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蛋白质之间的相互作用(简称蛋白互作)是指两种或两种以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体的过程。蛋白互作构成了细胞生化反应网络的重要组成部分。因此,研究蛋白质之间的相互作用不仅可从分子水平揭示蛋白的结构与功能,而且为病原微生物的致病机理及动物疫病防控的研究提供新途径。转化生长因子-β激活激酶1(transforming growth factor-βactivated kinase-1,TAK1)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员。TAK1结合蛋白(TAK1-binding protein 1,TAB1)是一种广泛存在于无脊椎和脊椎动物细胞中的高度保守的免疫相关蛋白。目前已探明哺乳动物的TAB1通过与TAK1的互作参与调控多个细胞信号转导通路,在细胞分化、细胞凋亡和天然免疫应答中发挥重要作用。与哺乳动物相比,鱼类TAB1与TAK1蛋白互作研究起步较晚,仅见有大黄鱼TAB1与TAK1互作研究的文献报道。我们前期研究发现,拟态弧菌靶向核酸疫苗可显著增强草鱼肠黏膜免疫,免疫肠组织中CiTAB1基因显著上调并富集于多个天然免疫信号通路,但CiTAB1与CiTAK1之间是否存在互作关系尚不清楚。对此,本课题以CiTAB1为研究对象,分析CiTAB1基因在健康草鱼组织及免疫刺激前后细胞中的转录表达模式,确定CiTAB1蛋白的亚细胞定位及其与CiTAK1共定位情况。在此基础上,联合利用免疫共沉淀技术和Pull-down试验验证CiTAB1与CiTAK1是否存在互作关系。主要研究内容与结果总结如下:1)CiTAB1基因的转录表达模式分析:论文中用TRNzol-A+总RNA提取试剂提取健康草鱼组织总RNA、反转录为cDNA,并以此为模板采用RT-qPCR检测CiTAB1基因在9种不同组织中的转录表达谱,结果发现该基因在各检测组织中广泛转录表达。随后,分别用脂多糖、肿瘤坏死因子-α和拟态弧菌疫苗抗原三种不同免疫刺激剂以不同浓度刺激草鱼肾细胞(CIK细胞),采用RT-qPCR检测刺激前后不同时间CiTAB1基因的时序转录表达水平。结果表明,CiTAB1是一种免疫相关蛋白,三种免疫刺激剂均能刺激其转录表达水平显著上调,但时序变化水平依刺激物及其浓度的不同而异。2)CiTAB1蛋白亚细胞定位及其与CiTAK1共定位确定:论文中首先利用在线分析软件预测CiTAB1蛋白的亚细胞定位。然后,构建带有红色荧光标签的真核重组质粒pmCherry-C1-CiTAB1。最后,将pmCherry-C1-CiTAB1单转CIK与HEK293T细胞或与p EGFP-C1-CiTAK1共转HEK293T细胞,并经多聚甲醛固定细胞和DAPI染核后,在荧光显微镜下(400×)下观察荧光蛋白表达情况。结果显示,(1)预测到CiTAB1蛋白可能分布在细胞核中;(2)转染重组质粒pmCherry-C1-CiTAB1的CIK和HEK293T细胞的胞质与核胞核部位均发出红色荧光;(3)共转染pmCherry-C1-CiTAB1和p EGFP-C1-CiTAK1的HEK293T细胞中绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白重叠,在胞质中形成黄色荧光。结果表明CiTAB1蛋白分布在胞质与胞核中,并与CiTAK1在胞质中存在共定位。3)CiTAB1与CiTAK1的互作验证:论文中将pmCherry-C1-CiTAB1与pCMV-myc-CiTAK1或标签蛋白(pCMV-Myc,pmCherry-C1)共转染HEK293T细胞,以转染细胞裂解液与anti-Myc免疫磁珠进行免疫共沉淀,并通过免疫印迹检测蛋白间是否存在互作。结果显示anti-Myc单抗能从转染pmCherry-C1-CiTAB1与pCMV-Myc-CiTAK1以及pCMV-Myc-CiTAK1与pmCherry-C1的IP裂解液中检测到Myc-CiTAK1;anti-m Cherry单抗能从转染pmCherry-C1-CiTAB1与pCMV-Myc-CiTAK1的IP裂解液中检测到Cherry-C1-CiTAB1。结果表明CiT AB1与CiTAK1在细胞内存在互作关系。为了进一步验证上述两种蛋白是否能在体外直接结合,以纯化的His-CiTAB1融合蛋白为诱饵蛋白,CiTAK1为猎物蛋白进行His pull-down和免疫印迹检测。结果发现anti-His单抗可从转染细胞裂解液与重组蛋白或标签蛋白的混合物中检测到融合蛋白His-CiTAB1及His标签蛋白;anti-Myc单抗能从转染pCMV-Myc-CiTAK1的细胞裂解液与融合蛋白的混合物中检测到Myc-CiTAK1,但在与标签蛋白的混合物中未能检测到该蛋白。结果表明CiTAB1能与CiTAK1在体外直接结合。综上所述,CiTAB1基因在草鱼组织中广泛转录表达,免疫刺激剂可显著提高其转录表达水平。CiTAB1蛋白在胞质与胞核内均有分布,且与CiTAK1蛋白在胞质中存在共定位。CiTAB1蛋白和CiTAK1蛋白在体外细胞内存在直接互作关系。