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花柱引导组织特异性糖蛋白(Transmitting tract-specific glycoprotein，TTS)是一类富含脯氨酸并且高度糖基化的蛋白，属于阿拉伯半乳聚糖蛋白家族(Arabinogalactan-proteins，AGPs)成员，主要功能是作为信号分子或者营养供体调控花粉管的生长，但是其具体作用机制尚不明确。因此，本研究以‘砀山酥梨’的花粉和花柱为材料，探讨梨花柱中表达的PbrTTS1调控‘砀山酥梨’花粉管生长发育的分子机制。主要结果如下:
1.从梨基因组中共鉴定出782个富含羟脯氨酸的糖基化蛋白家族(Hydroxyproline-rich glycoproteins，HRGPs)成员，HRGPs的氨基酸序列中富含脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。其可以划分为3个家族，分别是AGPs、中度糖基化的伸展蛋白家族(Moderately glycosylated extensins，EXTs)和轻度糖基化的富含脯氨酸的蛋白家族(Lightly glycosylated proline-rich proteins，PRPs)。复制模式分析表明全基因组复制(Whole genome duplication，WGD)是梨HRGPs扩张的主要驱动力。HRGPs氨基酸序列中多个位点的选择压力大于1，并且Hyp-rich区域可以影响基因的进化速率，这也是导致HRGPs家族成员结构多样的主要原因。另外，WGD复制产生的基因表现出较高的表达分化趋势。HRGPs基因主要在花柱中表达，在花粉和果肉中的表达量相对较少。总之，Hyp-rich区域是HRGPs基因家族扩张、进化和基因功能分化的主要原因。
2.PbrTTS1是AGPs家族成员。为探究其对花粉管生长的影响，利用原核系统表达重组PbrTTS1蛋白。用重组PbrTTS1蛋白处理‘砀山酥梨’的花粉管，发现重组蛋白可以促进离体培养的‘砀山酥梨’花粉管的生长，说明糖基化修饰不影响PbrTTS1促进花粉管生长的生物学功能。为进一步探究PbrTTS1促进花粉管生长的调控机制，构建了萌发3h的梨花粉cDNA文库。以PbrTTS1为诱饵从cDNA文库中筛选出13类候选蛋白，主要包括F-box蛋白、类防御素蛋白、C2保守域的蛋白、果胶酯酶、快速碱化因子和E3泛素连接酶等。本文重点研究了含有C2保守域的蛋白(Pollen C2 domain-containing protein，PCCP)和快速碱化因子多肽(Rapid alkalinization factor，RALF)。
3.结合cDNA文库结果，以及烟草中的NaPCCP功能的相关报道。本研究通过生物信息学分析、组织定位分析、表达模式分析等方法在梨中鉴定出PbrPCCP1基因。PbrPCCP1主要在花粉中表达并且定位在质膜上。酵母双杂交试验、双分子荧光互补试验和荧光素酶互补试验表明PbrPCCP1可以与PbrTTS1互作，并且PbrTTS1的PollenoleeⅠ保守结构域是互作的关键位点。利用反义寡核苷酸技术(Antisense oligonucleotide，As-ODN)抑制花粉管中PbrPCCP1的表达，花粉管的正常生长受到抑制。同时，利用as-ODN技术抑制花粉中PbrPCCP1的表达之后，PbrTTS1对花粉管生长的促进效果被减弱。
4.RALF是一类富含半胱氨酸的多肽，参与植物生长发育的多个过程。梨中共鉴定出24个PbrRALF家族成员，并且PbrRALF2通过改变梨中类受体激酶(Receptor-like kinase，RLK)PbrCrRLK1L13的磷酸化水平来抑制花粉管的生长。本研究结合cDNA文库筛选的结果，进一步从梨中筛选出3个与PbrTTS1互作的蛋白，分别是PbrRALF5/17/19。进一步通过RT-PCR和RT-qPCR方法分析PbrRALF家族成员在梨花柱中的表达模式，结果显示17个基因在花柱中表达，并且PbrRALF19在异花授粉前后花柱中的表达量有显著性差异，其在授粉后的花柱的表达量显著性上升。另外，酵母双杂交试验表明PbrTTS1与PbrCrRLK1L13胞外域互作。采用生物膜干涉技术计算PbrTTS1和PbrCrRLK1L13胞外域之间的亲和力常数为KD～3.07E-06M。酵母三杂交试验表明PbrTTS1抑制PbrCrRLK1L13胞外域和PbrRALF2之间的互作。ODN结果表明，抑制花粉管中PbrCrRLK1L13表达之后，用重组PbrTTS1蛋白处理花粉管可以显著的促进花粉管的生长。综上所述，PbrTTS1与PbrRALF2竞争性的与PbrCrRLK1L13的胞外域互作，从而调控花粉管的生长。另外，PbrRALF19与PbrTTS1互作，从而减弱PbrTTS1对PbrRALF2与PbrCrRLK1L13的抑制效果。
1.从梨基因组中共鉴定出782个富含羟脯氨酸的糖基化蛋白家族(Hydroxyproline-rich glycoproteins，HRGPs)成员，HRGPs的氨基酸序列中富含脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。其可以划分为3个家族，分别是AGPs、中度糖基化的伸展蛋白家族(Moderately glycosylated extensins，EXTs)和轻度糖基化的富含脯氨酸的蛋白家族(Lightly glycosylated proline-rich proteins，PRPs)。复制模式分析表明全基因组复制(Whole genome duplication，WGD)是梨HRGPs扩张的主要驱动力。HRGPs氨基酸序列中多个位点的选择压力大于1，并且Hyp-rich区域可以影响基因的进化速率，这也是导致HRGPs家族成员结构多样的主要原因。另外，WGD复制产生的基因表现出较高的表达分化趋势。HRGPs基因主要在花柱中表达，在花粉和果肉中的表达量相对较少。总之，Hyp-rich区域是HRGPs基因家族扩张、进化和基因功能分化的主要原因。
2.PbrTTS1是AGPs家族成员。为探究其对花粉管生长的影响，利用原核系统表达重组PbrTTS1蛋白。用重组PbrTTS1蛋白处理‘砀山酥梨’的花粉管，发现重组蛋白可以促进离体培养的‘砀山酥梨’花粉管的生长，说明糖基化修饰不影响PbrTTS1促进花粉管生长的生物学功能。为进一步探究PbrTTS1促进花粉管生长的调控机制，构建了萌发3h的梨花粉cDNA文库。以PbrTTS1为诱饵从cDNA文库中筛选出13类候选蛋白，主要包括F-box蛋白、类防御素蛋白、C2保守域的蛋白、果胶酯酶、快速碱化因子和E3泛素连接酶等。本文重点研究了含有C2保守域的蛋白(Pollen C2 domain-containing protein，PCCP)和快速碱化因子多肽(Rapid alkalinization factor，RALF)。
3.结合cDNA文库结果，以及烟草中的NaPCCP功能的相关报道。本研究通过生物信息学分析、组织定位分析、表达模式分析等方法在梨中鉴定出PbrPCCP1基因。PbrPCCP1主要在花粉中表达并且定位在质膜上。酵母双杂交试验、双分子荧光互补试验和荧光素酶互补试验表明PbrPCCP1可以与PbrTTS1互作，并且PbrTTS1的PollenoleeⅠ保守结构域是互作的关键位点。利用反义寡核苷酸技术(Antisense oligonucleotide，As-ODN)抑制花粉管中PbrPCCP1的表达，花粉管的正常生长受到抑制。同时，利用as-ODN技术抑制花粉中PbrPCCP1的表达之后，PbrTTS1对花粉管生长的促进效果被减弱。
4.RALF是一类富含半胱氨酸的多肽，参与植物生长发育的多个过程。梨中共鉴定出24个PbrRALF家族成员，并且PbrRALF2通过改变梨中类受体激酶(Receptor-like kinase，RLK)PbrCrRLK1L13的磷酸化水平来抑制花粉管的生长。本研究结合cDNA文库筛选的结果，进一步从梨中筛选出3个与PbrTTS1互作的蛋白，分别是PbrRALF5/17/19。进一步通过RT-PCR和RT-qPCR方法分析PbrRALF家族成员在梨花柱中的表达模式，结果显示17个基因在花柱中表达，并且PbrRALF19在异花授粉前后花柱中的表达量有显著性差异，其在授粉后的花柱的表达量显著性上升。另外，酵母双杂交试验表明PbrTTS1与PbrCrRLK1L13胞外域互作。采用生物膜干涉技术计算PbrTTS1和PbrCrRLK1L13胞外域之间的亲和力常数为KD～3.07E-06M。酵母三杂交试验表明PbrTTS1抑制PbrCrRLK1L13胞外域和PbrRALF2之间的互作。ODN结果表明，抑制花粉管中PbrCrRLK1L13表达之后，用重组PbrTTS1蛋白处理花粉管可以显著的促进花粉管的生长。综上所述，PbrTTS1与PbrRALF2竞争性的与PbrCrRLK1L13的胞外域互作，从而调控花粉管的生长。另外，PbrRALF19与PbrTTS1互作，从而减弱PbrTTS1对PbrRALF2与PbrCrRLK1L13的抑制效果。