研究背景：腹泻病(Diarrhea Disease)是一组多因素多病原引起的疾病,以大便次数多和大便性状改变为主要特点的一种儿科常见疾病,是世界性公共卫生问题。主要包括细菌性腹泻、寄生虫性腹泻和病毒性腹泻,其中病毒性腹泻是引起急性重症腹泻的重要原因之一。1972年首次发现诺瓦克病毒之后,已相继发现和确立了3种引起腹泻的RNA病毒,它们是轮状病毒(RV)、杯状病毒(HuCVs)和星状病毒(ASTV),并已被确定为医学上重要的病原体。Aichi病毒也可以引起急性腹泻,但没有大规模爆发的报道。此外,有少量研究表明双埃可病毒(HPeV)和肠道病毒(EV)等也可引起腹泻。近年来病毒性腹泻越来越受WHO和各国疾控部门的重视,开展多病毒的检测为腹泻相关病毒的诊断、预防和控制提供理论依据。人轮状病毒是引起五岁以下婴幼儿病毒性腹泻最主要的病原生物,属于呼肠弧病毒科,轮状病毒属。据WHO2008年统计每年约有45万婴幼儿死于疫苗可保护的轮状病毒感染,并且这些儿童主要生活在低收入国家。轮状病毒基因组由11条双链RNA组成,被内层结构蛋白VP1、VP2和VP3包绕,VP6构成中间层蛋白,外层衣壳包括VP7和VP4。根据VP7和VP4编码基因序列的不同,分别决定轮状病毒的G和P基因型。全球常见流行型G1-G4, G9, P[4],P[8],而我国主要型别是G1、G2、G3、G9、P[4]和P[8]。目前尚没有针对轮状病毒的特效药物,接种疫苗被认为是预防轮状病毒的最有效的手段。研究表明针对VP7/VP4的中和抗体具有保护性作用,因此轮状病毒分型为轮状病毒病毒的诊断、疫苗的应用提供理论依据。研究目的：1.建立腹泻相关病毒荧光定量PCR方法,并对该方法进行评价,以实现腹泻相关病毒的快速检测,为病毒性腹泻暴发流行的应对提供技术储备。2.建立A组轮状病毒多重荧光定量PCR分型方法,并对该方法进行评价,实现A组轮状病毒不同基因型的快速鉴定和定量,为RV的基因分型提供新的方法。研究方法：通过对2011年轮状病毒复核粪便标本基因测序,获得VP4和VP7片段的序列,GenBank数据库获得腹泻相关病毒的基因序列。使用MAGE软件进行比对和分析后确定各基因型和腹泻相关病毒的特异靶序列。在统一PCR反应条件的前提下利用Primer软件设计引物和TaqMan探针。通过Blast程序初步分析各引物-探针对检测的特异性。将目的片段连接至pGEM-T Easy载体上,使目的片段获得T7启动子。体外转录合成靶基因的RNA模板,利用各个RNA参考品进行荧光定量RT-PCR检测,建立标准曲线,并对方法的的灵敏度、特异性和重复性进行评估；利用盲样和临床样品对检测方法的实用性进行初步评价。结果：1.腹泻相关病毒荧光定量PCR方法的建立与评价利用RNA参考品进行单重荧光定量RT-PCR检测,建立标准曲线,评价各体系的灵敏度,检出限在70-570copies/PCR;在各病毒间对引物-探针对之间的交叉反应进行验证,各引物-探针对与其他病毒和腺病毒均无明显扩增,表明具有良好的特异性；并通过重复性实验验证各体系的稳定性,其CT值的变异系数均小于5%,表明有较好的重复性；盲样检测结果显示该方法能够快速准确地确定引起腹泻的病毒；利用腹泻患儿粪便标本对方法的实用性进行初步评价,RV、 NV、AST、EV、HPeV、SaV和Aichi的检出率分别为44.57%、17.39%、6.52%、7.61%、4.35%、9.78%和0.0%。2.轮状病毒多重荧光定量PCR分型方法的建立利用各个型别RNA参考品进行单重荧光定量RT-PCR检测,建立标准曲线,评价各体系的灵敏度,检出限在30-150copies/PCR;对引物-探针对之间的交叉反应进行验证,各引物-探针对其他型别、肠道腺病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒和双埃可病毒均无明显扩增,表明具有良好的特异性。在多重荧光定量RT-PCR的条件下,建立标准曲线,评价各体系的灵敏度,检出限在30～240copies/PCR,与单重条件下的结果无明显差异；并通过重复性实验验证各体系的稳定性,其CT值的变异系数均小于5%,表明有较好的重复性；利用腹泻患儿轮状病毒阳性粪便标本对方法的实用性进行初步评价,与传统分型方法进行比较,本实验方法能够准确快速地进行分型定量。结论：本研究建立了腹泻相关病毒(Aichi、ASTV、EV、HPeV、RV和SaV)荧光定量PCR方法,该方法的灵敏度高、特异性和稳定性好,能够在相同的反应条件下快速确定引起腹泻症状的病毒,为病毒性腹泻暴发流行的应对提供技术储备。本研究建立了轮状病毒多重荧光定量PCR方法,该方法的灵敏度高、特异性和稳定性好,可以用于我国常见轮状病毒流行型别的快速检测、定量与分型,为RV的基因分型提供新的方法。