水稻小穗小粒基因SPG1的图位克隆与功能鉴定

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大米是人们日常食用的主食之一,稻米的种植与生产在世界范围内都有着重要的地位。但近年来随着世界人口的增长,仍需要进一步提高水稻(Oryza sativa L.)产量。在水稻育种上,株高、穗型、籽粒大小和叶片等因素均与水稻产量密切相关。株高影响抗倒伏性,穗型和籽粒大小直接决定了水稻产量高低,叶片通过光合作用促进淀粉等糖类物质的合成影响产量。因此对水稻株高、穗型、籽粒大小和叶片等性状的基因克隆和性状改良将有助于进一步提高水稻产量。本研究的突变体材料由EMS(ethylmethane sulfonate)诱变籼稻保持系西大1B后筛选获得,突变体表现为小穗小籽粒,命名为spg1(small panicle and grains 1)。利用现代生物学技术方法对spg1展开了基因定位、农艺性状观察、组织学分析、基因表达模式分析和基因功能分析等研究。得到如下结果:1.spg1的农艺性状考察比较成熟期野生型和spg1的表型发现,spg1株高半矮化,有效分蘖数增多,穗长变短,籽粒长度和宽度都变小,千粒重降低。同时spg1的一次枝梗数和二次枝梗数增加,因此spg1每穗粒数显著增多,单株产量比野生型提高。2.spg1的组织学分析为探究spg1株高变矮和籽粒变小的主要原因,对苗期野生型和spg1叶鞘细胞进行扫描电镜分析发现,spg1叶鞘细胞长度变短,细胞宽度无显著改变。对孕穗期野生型和spg1倒二节间的石蜡切片分析发现,spg1薄壁细胞长度和宽度都变小,因此spg1细胞变小导致株高变矮。另外,取孕穗期野生型和突变体小穗进行石蜡切片和扫描电镜分析,结果表明,spg1颖壳细胞数目减少导致spg1籽粒变小。3.spg1叶片的扫描电镜观察spg1叶片比野生型更加光滑。对成熟期野生型和spg1叶片进行扫描电镜观察发现,spg1叶片表面的表皮毛数量比野生型明显减少。因此,spg1叶片表皮毛数目减少导致叶片更加光滑。4.SPG1的遗传分析和基因定位将spg1和恢复系缙恢10号配制杂交组合,F1代群体植株表型与野生型相似,而将F1群体自交得到的F2代群体出现性状分离现象。统计F2代所有单株,经卡方检验,其分离比符合基因分离定律的3:1,表明spg1是单基因突变。通过图位克隆最终将SPG1定位在2号染色体v-10和v-9标记之间的70kb范围内。在该区间内有9个注释基因,分别进行DNA测序,结果发现,突变体spg1中的LOC_Os02g25230外显子第953位碱基C缺失,初步定为候选基因。为验证此候选基因,构建了该基因的互补载体转化到spg1突变植株中进行互补实验。对成熟期阳性互补植株观察发现,阳性植株的表型均恢复至野生型水平。对阳性植株DNA测序结果表明,阳性转基因植株突变位点序列为双峰。证明目的基因为LOC_Os02g25230。5.SPG1的亚细胞定位将SPG1的全部编码序列融合到绿色荧光蛋白(GFP)N端构建pAN580-SPG1载体并转化到水稻原生质体。实验结果表明,SPG1-GFP融合蛋白信号与细胞核Marker信号重合,表明SPG1定位在细胞核内。6.SPG1的表达模式分析提取野生型各组织部位的RNA进行半定量和定量PCR实验,结果表明,SPG1在根、茎、叶、枝梗、穗等部位都有表达。另外,对SPG1基因启动子+GUS阳性转基因植株各组织部位的GUS染色结果与定量和半定量表达结果一致。均表明SPG1基因在水稻各组织均有表达,在穗部和茎杆中的表达量最高。7.SPG1的基因功能分析对转基因植株的表型鉴定发现,成熟期SPG1干涉转基因植株的株高变矮,穗长变短,籽粒变小,叶片表皮毛数量减少。而超表达转基因植株的表皮毛数量显著增加。表明SPG1正调控水稻叶片表皮毛数量和水稻株高以及籽粒大小。
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