背景非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种以肝脏内甘油三脂(triglyceride, TG)积聚为特征的肝脏疾病,病理组织学光镜下约5%的肝细胞可以看到脂肪样变,或者甘油三脂较正常人高出95%以上,且排除酒精性肝病、病毒性肝炎及自身免疫性肝病,即可诊断为非酒精性脂肪肝。随着人们生活水平的提高,NAFLD发病率逐年上升,正迅速成为世界范围的健康难题。NAFLD的发病机制尚未明确,目前推崇“二次打击学说”即胰岛素抵抗和氧化应激。其发病过程如下：首先进入肝脏的游离脂肪酸增多,随之肝脏中促进脂肪酸氧化的相关蛋白如脂联素下降,肝脏出现脂肪变性,这个期称为单纯性非酒精性脂肪肝。当脂肪氧化超过肝脏代谢的最大极限时,氧化应激随即产生,表现为释放活性氧(ROS)及肠道相关物质的释放如细菌内毒素、短链脂肪酸等；这时炎症细胞因子和脂肪因子的释放会失衡,这个期称为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)。以上因素未能解除时,其可进入更为严重的分期：脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化。NAFLD与代谢综合征(MetS)>2型糖尿病以及肥胖密切相关,它们存在共同的发病机制,包括胰岛素抵抗和全身性炎症反应。蛋白激酶Cε (protein kinase Cε, PKCε)是PKC家族的一种亚型,在肝脏中的表达较高；也是与肝脏胰岛素抵抗高度相关的一种蛋白,在胰岛素抵抗病理生理过程的细胞内信号通路中起着重要的作用。研究表明在NAFLD中PKCε可被激活,主要表现为PKCε由胞浆转位至包膜上,此时PKCε在胞浆中的表达下降。人体及NAFLD动物模型实验均表明肝脏内脂质、二酰甘油(diacylglycerol, DAG)的积聚可活化PKCε从而引起肝脏的胰岛素抵抗。Toll样受体是横跨膜模式识别受体(PRR)家族,其中TLR4是研究最多的一种TLRs,其主要外源性配体是脂多糖(LPS),革兰氏阴性细菌细胞壁的一个组成部分。缺乏外源性细菌时,内源性配体包括基质损伤产生的损伤相关性的化学分子及损伤的细胞,它们均能激活TLR4信号通路。TLR4在肝脏的实质和非实质细胞均有表达,并积极参与应对各种病因引起的损伤,包括病毒性肝炎、酒精性肝病和NAFLD、自身免疫性肝病和药物引起的肝脏疾病。NF-κB是一种多效性蛋白复合体,在胞浆中与iκB(NF-κB的抑制剂)结合在一起,以无活性形式存在。当细胞外复杂的信号如TLR4信号的作用,iκB降解,NF-κB以具有活性的形式进入细胞核,此时可以激活转录。NF-κB的激活在肝脏炎症、肝纤维化的发展中起重要作用,保护肝细胞免受TNF-a等炎性因子诱导的细胞死亡,和补偿的肝细胞增殖反应可修补肝损伤,因此它可以反映肝损伤的情况。TLR4信号通路在肝脏中有完整的表达,其中TLR4/NF-κB分支在NAFLD进展中起着重要作用,它调控肝脏的炎症反应、纤维化进程及及肝细胞凋亡。针对以上NAFLD的发病机制,NAFLD的治疗主要以改善胰岛素抵抗及肝脏氧化应激为主,但由于过程复杂,至今仍缺乏有效的治疗药物。目前NAFLD的主要治疗方法主要以改变生活方式和调整饮食结构、加强运动为主,为NAFLD寻求新的治疗药物已成为NAFLD研究领域的热点。胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptidel, GLP-1)是一种内源性肠促胰岛素,人体中的GLP-1与GLP-1受体结合后发挥作用,能够促进胰岛p细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素。利拉鲁肽与人体中的GLP-1具有97%的同源性,是GLP-1的高度同源类似物,在体内起作用的成分是GLP-1。它能够以葡萄糖浓度依赖的模式刺激胰岛素分泌,当血糖升高时,胰岛素分泌受到刺激,同时胰高糖素分泌受到抑制。与之相反,在低血糖时利拉鲁肽能够减少胰岛素分泌。本课题组的前期研究表明利拉鲁肽可以改善NAFLD大鼠TNF α、TGF β的水平及氧化应激。但具体机制仍不十分明确,而PKCε与胰岛素抵抗密切相关,TLR4/NF-κB则与肝脏炎症反应相关,那么GLP-1能否对它们产生作用呢?本研究通过利拉鲁肽干预NAFLD大鼠模型,来探讨GLP-1对NAFLD大鼠脂质代谢、肝功能、胰岛素抵抗的影响,并进一步探讨其对PKCε, TLR4/NF-κB信号通路的影响,以期为治疗NAFLD的研究领域提供新的理论证据。目的本课题拟以高脂饮食12周诱导建立NAFLD的SD大鼠模型,予利拉鲁肽干预4周后通过1)测定血清中血清甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、葡萄糖(GLU)、胰岛素(insulin);2)测定肝匀浆中TG、TC;HE染色观察肝脏的脂肪变性程度；3)PKCε、TLR4的mRNA表达；4) PKCε、TLR4、NF-κB的蛋白表达。从而观察该药物对脂质代谢、胰岛素抵抗的影响、病理变化,及胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)相关信号通路蛋白的表达进而来探讨GLP-1对高脂饮食SD大鼠的治疗作用及其可能的机制,以期为利拉鲁肽成为治疗NAFLD的新药物提供理论证据。方法1、实验动物的来源及分组：32只SPF级雄性SD大鼠(体重约120 g士10)购自中山大学,具有动物合格证,动物实验获得伦理委员会批准。按随机数字表法随机将其分为2组实验组21只,正常对照组(normal control, NC组)11只。2、建立NAFLD大鼠模型：实验组大鼠予高脂饲料(88%普通饲料+10%猪油+2%胆固醇)喂养12周,动物统一自由进食。12周后,对高脂饮食大鼠进行模型鉴定：第12周末实验组和NC组分别随机抽取1只大鼠,禁食12 h后,水合氯醛麻醉后抽取静脉血10mL全自动生化仪检测血清TG、TC、AST、ALT。处死后取出肝脏病理切片HE染色观察肝组织脂肪变情况,NAFLD模型建立成功标准参照文献报道。3、利拉鲁肽干预方法：造模成功后,将实验组大鼠按随机数字表法随机分为2组,每组10只：模型对照组(high fat diet, HFD)予高脂饮食+腹腔注射等体积的无菌生理盐水,GLP-1治疗组(HFD+GLP-1)予高脂饮食+腹腔注射GLP-1注射液(0.6mg/kg.d)。干预期间SD大鼠自由饮食饮水,分成6笼,每笼5-6只,温度20℃-25℃,动物室内照明设置为明暗各12小时左右。注意观察大鼠的毛发改变,食欲、大小便、活动、体重等变化情况,根据大鼠体重并按0.6 mg/kg.d标准调整每日注射量。第16周末,所有大鼠禁食12h,禁水6h后,水合氯醛麻醉后抽取静脉血10 mL,并取肝脏组织,一部分液氮速冻后存放于-80℃低温冰箱备用,另留取部分肝组织10%中性甲醛浸泡固定备用。4、肝指数麻醉前称取大鼠的体重(g),取出肝脏后予0.9%生理盐水漂洗后称取肝重(g),肝指数=肝重/体重×100%。5、血液处理及相关指标检测：血液标本常温静置30min,3500r/min离心15 min后取上层血清至1.5 mL EP管中并做好标记,全自动生化仪检测血清的ALT、AST、TG、TC,用葡萄糖检测试剂盒检测血清的GLU；酶联免疫吸附法(ELISA)法测定血清胰岛素(fasting insulin, FIN),胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),计算公式为：(FPGxFIN)/22.5 (FPG单位为mmol/L; FIN单位为μIU/mL)。6、10%肝匀浆制备及相关指标测定：称取肝右叶中央部位组织100mg,冰冻生理盐水漂洗后加入1.9ml匀浆介质,冰浴下使用匀浆器匀浆(2000r/min) 5min后离心吸取上清即为10%肝匀浆。使用GPO-PAP法检测匀浆中的TGTC。7、石蜡包埋肝组织做病理切片及HE染色：取大小约0.5 cmx0.5 cmx0.5 cm的肝组织,用10%中性甲醛固定24 h,石蜡包埋,切片机切厚度为5μm的片子,HE染色,光镜下观察肝脏形态学的改变并对脂肪变性进行评估,每张切片观察5个视野,根据光镜下每面积见的肝脂肪病变对肝脏脂肪变性程度分级：正常(-)：肝小叶结构良好,基本无脂肪病变；轻度(+)：小于1/3肝细胞发生脂肪变；中度(++)：即1/3-2/3以上的肝细胞脂变；重度(+++)：即大于2/3肝细胞发生脂肪变。8、RT-PC(?)法测定肝组织PKCε、TLR4的mRNA表达：取出冰冻肝组织,解冻后冰冻生理盐水洗净血液后称取50-100 mg肝组织研钵中液氮下磨成粉末状转移至无酶EP管中,加入1mL TRIZOL吹打混匀,冰上静置10 min加入0.2mL氯仿,剧烈震荡15s,静置3 min,4℃1200xg离心15 min取上清加入等体积异丙醇,静置5min 4℃1200xg离心15 min;弃上清加入1 mL 75%乙醇充分洗涤沉淀后4℃1200xg离心8 min室温干燥,加入30-70 μL DEPC水溶解沉淀。进行RNA浓度测定后进行逆转录,RT-PCR检测PKCεmRNA表达。以GAPDH为内参。每个样本重复3次,每次包括3个不加cDNA模板的阴性对照和只加DEPC水的空白对照。取ct平均值,采用相对定量法分析结果,以2-△△Ct方法判定模型组及GLP-1干预组相对于空白对照组肝组织中PKCs基因的相对表达倍数。Ct代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数,△△Ct=(CtPKCε/TLR4-CtGAPDH)处理组一(CtPKCε/TLR4 —CtGAPDH)对照组。9、Western blot测定肝组织胞浆PKCε、TLR4蛋白表达：取适量肝组织液氮下研磨成粉末,加入1 mL浆蛋白抽提液冰上裂解1 h。4℃14000xg离心30 min取上清。BCA法测定蛋白浓度,取50 pg蛋白进行SDS-PVDF电泳,60 V恒压30 min,110 V恒压60 min。采用湿转法进行转膜(250 mA,150 min);5%脱脂奶封闭2 h；PKCε兔多克隆抗体(1：500)购自Abcam, TLR4兔多克隆抗体(1：200)购自Santa Cruz 4℃孵育过夜,Ⅱ抗(羊抗兔1：3000)室温孵育1 h, ECL液进行曝光,使用FluorChem 8900软件对结果灰度值进行分析。10、免疫组化检测NF-κB蛋白表达：10%中性甲醛固定肝组织后进行石蜡包埋,石蜡切片脱蜡至水洗,抗原修复,阻断内源性过氧化物酶,加NF-κB兔多抗(1：100)购自Santa Cruz,加Ⅱ抗(羊抗兔1：100),DAB显色,复染细胞核,脱水封片,光镜下观察,每张切片取5个高倍镜视野(每个视野>500个细胞),分别计算阳性率,阳性率=阳性细胞数/总细胞数×100%。11、数据分析：采用SPSS13.0统计软件进行分析,计量资料均以均数±标准差；多组间的比较,采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐者(P>0.05)用LSD检验进行组间的两两比较,方差不齐者(P<0.05)采用Welch校正法,组间两两比较用Dunnett’s T3法。等级资料采用Kruskal-Wallis H非参数检验进行分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果1、各组大鼠肝指数的变化与NC组比,HFD组的肝指数明显升高(30.96±3.46versus23.02±1.52,p<0.05)’,与HFD组相比,GLP-1给药4周后,HFD+GLP-1组的肝指数显著降低(27.53±3.23 versus 30.96±3.46,P<0.05)。2、各组大鼠血清ALT, AST, TG , TC的变化与NC组比,HFD组血清的ALT,AST,TG,TC明显升高((87.14±19.04 versus 67.00±17.64, 176.14±30.04 versus 98.00±44.37, 1.94±0.76 versus 0.62±0.23, 2.44±0.25versus 1.30±0.12,2.44±0.25versus 1.30±0.12,P<0.05 ) ;与HFD组比,给药4周后,HFD+GLP-1组血清的ALT、AST、TG、TC均明显减低(59.00±15.82 versus 87.14±19.04, 124.25±24.52 versus 176.14±30.04,1.35±0.54 versus 1.94±0.76, 2.05±0.23 versus 2.44±0.25,P<0.05) .3、各组大鼠10%肝匀浆中TG, TC的变化与NC组比,HFD组肝匀浆中的TG, TC明显升高(2.89±0.19 versus 1.74±0.22 ,2.20±0.22 versus1.30±0.12,P<0.05)与HFD组比,给药4周后,HFD+GLP-1组肝匀浆中的TG, TC均明显减低(1.35±0.54 versus 2.89±0.19, 1.17±0.16 versus 2.20±0.22,P<0.05 ) .4、各组大鼠病理学观察脂肪变情况与NC组比较,HFD组大鼠肝脏脂肪变程度明显增加(PO.05), GLP-1干预4周后,大鼠肝脏脂肪变程度明显减低恢复至正常(P<0.05)。5、各组大鼠胰岛素及胰岛素抵抗指数的变化与NC组相比,HFD组大鼠血清胰岛素升高(P<0.05)o GLP-1治疗4周后,大鼠血清胰岛素降低(P<0.05)。6、各组大鼠肝组织PKCε的mRNAmRNA表达变化HFD组较NC组表达下降(P<0.05), HFD+GLP-1组较HFD组表达升高(P<0.05)。7、各组大鼠肝组织PKCs的蛋白表达变化与NC组相比,HFD组较表达下降(P<0.05),而HFD+GLP-1组较HFD组表达升高(P<0.05)。8、各组大鼠肝组织TLR4的mRNA表达变化HFD组较NC组表达升高(P<0.05),而HFD+GLP-1组较HFD组表达下降(P<0.05)。9、各组大鼠肝组织TLR4蛋白表达变化HFD组较NC组表达升高(P<0.05),而HFD+GLP-1组较HFD组表达下降(P<0.05)。10、各组大鼠肝组织NF-κB表达变化与NC组相比,HFD组NF-κB表达升高(P<0.05),而HFD+GLP-1组HFD组NF-κB表达下降(P<0.05)。结论1、本课题以SD大鼠为研究对象,通过12周的高脂饮食成功诱导建立NAFLD动物模型,该模型具有具有代谢紊乱(高脂血症)及肝功能异常(转氨酶升高)、病理组织学出现肝脏气球样变等特征,基本符合人类NAFLD的自然病理生理演变过程。2、GLP-1类似物可改善NAFLD大鼠的脂质代谢异常,同时可以逆转由高脂饮食诱导的肝脏脂肪变。3、GLP-1类似物可改善NAFLD大鼠的胰岛素抵抗,提高胰岛素敏感性,该过程可能与PKCε有关。4、GLP-1类似物可降低NAFLD大鼠肝组织中TLR4及NF-KB蛋白的表达,对炎症相关信号通路具有抑制作用。