免疫试纸条技术改进及高分辨熔解曲线应用菌群分类的初步摸索

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微生物的快速检测和分类方法研究是应用微生物领域的热点和难点。在微生物快速检测领域,50%以上食品中毒事件归因于食源性致病菌的感染,其快速检测技术备受关注;在微生物菌群分类领域,变性梯度凝胶电泳及温度梯度凝胶电泳技术日臻成熟,而高分辨熔解曲线技术的应用鲜见报道。免疫层析试纸条技术因其操作简便、快速且价格低廉等优点,广泛应用于食品安全快速筛查领域,并逐步拓展到食源性致病菌的现场快速检测及诊断。然而,传统的致病菌试纸条检测方法需制备特异性好,亲和力强的抗体,耗时耗力,且灵敏度不高。为此,本研究拟克罗诺杆菌和副溶血弧菌为检测对象,从两方面对其试纸条方法加以改进。一方面利用核酸杂交技术代替抗原抗体反应原理,制备了克罗诺杆菌核酸试纸条;另一方面,在传统试纸条的基础上,以副溶血弧菌为检测对象,利用胶体金标记的羊抗鼠二抗增强试纸条显色,提高其检测灵敏度。此外,为丰富微生物菌群分类的技术方法,本研究将高分辨熔解曲线技术初次应用于微生物的菌群分类分析。实验结果表明,制备的克罗诺杆菌核酸试纸条在纯培养物中的灵敏度为105CFU/mL,在添加108CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌的奶粉样品中的灵敏度为106CFU/mL。同时制备的副溶血弧菌免疫层析试纸条,加样5min后,加入由胶体金标记的羊抗鼠二抗,能将显色强度提高5倍,在纯培养物中试纸条的灵敏度为1×106CFU/mL,在同时添加108CFU/mL克罗诺杆菌、志贺氏菌的鱼肉糜样本中,检测限为107CFU/g。两种试纸条都表现出良好的特异性。高分辨熔解曲线能够区分单碱基差异的DNA片段,在熔解曲线上表现为熔解温度(Tm)的不同。本研究采用PCR扩增3号双歧杆菌,通过添加尿素、甲酰胺和盐酸胍等DNA变性剂,发现尿素和甲酰胺能够降低Tm值,盐酸胍升高Tm值。通过扩增小鼠肠道微生物的乳杆菌,加入不同浓度的DNA变性剂,成功在熔解曲线上对菌群种类进行了区分。本文建立了用于克罗诺杆菌和副溶血弧菌快速检测的试纸条方法,为其他食源性致病菌检测提供了可借鉴的研究模式;初次将高分辨熔解曲线应用于菌群种类分析,为菌群种类分析提供了新的思路。
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