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Cajal细胞(Interstitial cells of Cajal, ICCs)是一种特殊的间质细胞,以细胞网络的形式分布于整个胃肠道。它能自发性产生电慢波、整合并放大胆碱能和硝基能神经递质的传递,同时也是胃肠道张力感受器,在调节胃肠道平滑肌运动中具有重要作用。近年临床研究发现ICCs与一些新生儿胃肠运动功能障碍性疾病:如婴儿肥厚性幽门狭窄(Infantile hypert- rophic pyloric stenosis, IHPS)、先天性巨结肠(Hirschsprung’s disease, HD)、新生儿假性肠梗阻(neonatal pseudo-obstruction)及胃肠术后一过性肠麻痹等密切相关。尽管上述疾病的发病机制目前仍不十分清楚,但是均有相似的病理改变,即消化管壁内ICCs不同程度的减少,甚至缺如,同时ICCs彼此间及其与平滑肌细胞间不能形成完整的细胞网络,说明ICCs发育过程的延迟或异常可能是胃肠运动障碍性疾病的重要原因。因此,探讨新生小鼠消化管壁内ICCs的发育规律,将对阐明胃肠运动功能障碍性疾病的发病机制提供实验基础,并为治疗提供一定的指导作用。结肠壁内的ICCs根据分布的位置而分为四个不同的亚群:1)分布在肌间神经丛周围的ICCs(ICC-MY);2)环形平滑肌和纵形平滑肌内的ICCs(ICC-IM);3)浆膜下ICCs(ICC-SS)和4)粘膜下层靠近环肌面的ICCs(ICC-SM)。不同亚群的ICCs的功能存在差别,如ICC-SM是结肠的起搏细胞,ICC-IM介导兴奋性和抑制性神经递质的传递,而ICC-SS可能具有感受张力变化的作用。而且不同亚群的ICCs的发育过程也存在较大差异。因此,首先了解新生小鼠结肠不同亚群ICCs的发育过程是十分必要的。此外,在我们前期的实验结果显示,小鼠小肠ICCs从出生到成年细胞数量增加了近30倍,而且增加的细胞可能是由胰岛素样生长因子受体1(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)阳性的ICCs前体细胞的增殖而来。那么结肠内的ICCs是否有增殖?是否也存在前体细胞?也是我们关注的问题。ICCs持续表达由原癌基因c-kit编码的III型受体酪氨酸激酶受体Kit蛋白,它能够与平滑肌细胞Sl基因编码的干细胞因子(stem cell factor,SCF)结合,对ICCs的发育、存活、增殖和表型维持有重要的调控作用。在c-Kit突变的W/W~V小鼠、W/W~ S大鼠,或者Sl基因突变的Sl/Sl~d小鼠动物模型中;或者在胚胎晚期或生后早期,用Kit中和性抗体或Kit受体阻断剂阻断Kit受体功能;以及在体外培养体系中加入Kit中和性抗体或去除外源性SCF,都将导致胃肠壁内ICCs发育受阻,其数量明显减少,细胞网络被破坏,并伴有胃潴留、反流性食道炎、十二指肠内容物逆流等胃肠功能障碍的症状。我们前期对成年小鼠和豚鼠研究表明: Kit信号通路对小肠壁内ICCs的存活和自主节律性运动都具有重要作用。近年来的研究认为,出生后小鼠胃肠壁内同样存在ICCs前体细胞,但是不具有产生慢波的能力。在病理因素导致ICCs数量减少时,这些前体细胞在胰岛素(insulin)/胰岛素生长因子-I(insulin growth factor,IGF-I)信号和Kit/SCF信号的共同作用下,大量增殖再分化为成熟的,能产生自发性电活动的ICCs。那么Kit信号是否对结肠各亚型ICCs的发育和存活是否具有调控作用?各亚型ICCs的反应是否相同?Kit信号通路和IGF-1R信号通路对ICCs的增殖有何调控作用?这些问题也是我们关注的问题。本实验分为以下三个部分:第一部分:新生小鼠结肠ICCs的发育通过Kit蛋白免疫荧光染色特异性标记结肠ICCs,阐明不同部位不同亚型的结肠ICCs在生后(P0)到成年(P56)的过程中,细胞位置、形态、密度和总数的变化。主要结果如下:1. ICC-MY,ICC-IM,ICC-SS是出生0天即形成,ICC-SM是生后6天才出现于近端结肠,提示不同亚型的ICCs的发育过程有一定的时间差异。2. ICC-SM在P6出现于近端结肠,P8才见于远端结肠,提示同一亚型的ICCs在结肠不同部位的发育,存在时间顺序性。且ICC-MY在近端结肠的发育早于中间段,远端结肠的发育最晚。提示结肠ICCs是从头端向尾端的方向发育成熟的。3.出生后,随着结肠的长度、直径及表面积不断增加,各亚型ICCs的总数均不断增加。上述结果表明新生小鼠结肠ICCs逐渐发育成熟且数量不断增加,各亚型ICCs的发育存在一定的时间和空间顺序性,表现为结肠靠近头端的ICCs先发育,而各亚群中ICC-SM发育最迟。第二部分:新生小鼠结肠ICCs的增殖特点本研究通过BrdU标记和追踪增殖细胞,并结合抗核增殖抗原Ki67标记以及多重免疫荧光染色的实验方法,探讨出生后结肠ICCs的增殖潜能和规律。主要结果如下:1. ICC-MY,ICC-IM和ICC-SS具有增殖能力,在新生早期最旺盛,但随年龄的增长,增殖能力逐渐降低。2.新生小鼠结肠中存在Kit~+/IGF-IR~+/Ki67~+细胞,这些ICCs前体细胞,可能是增殖ICCs的主要来源。3. ICC-SM具有与其他亚群ICCs不同的增殖模式,其数目的增加可能是由Kit~-的前体细胞增殖随后开始表达Kit蛋白并分化为成熟的ICCs。上述结果表明结肠成体ICC-IM,ICC-MY,ICC-SS均具有增殖的潜能,在结肠生后发育过程中大量增加的细胞,可能是来源于Kit~+/IGF-IR~+前体细胞。Kit阳性的ICC-SM不具有增殖能力,其数量的增加的过程可能是Kit~-的前体细胞增殖后再分化为Kit~+的ICC。第三部分:Kit信号通路对新生小鼠结肠ICCs发育和增殖的调控利用Imatinib灌胃构建Kit信号通路被抑制的动物模型,BrdU腹腔注射,结合多重免疫荧光组织化学,激光共聚焦显微镜,western印迹的研究方法,探讨Kit信号通路和IGF-IR信号通路对小肠和结肠ICCs存活和增殖的调控机制,以及ICCs增殖的模式。主要结果如下:1. Imatinib能够有效在体抑制Kit信号通路的激活。2. Kit信号通路抑制后,除ICC-SM外的各亚群ICCs细胞数量明显减少,细胞网络不完整,说明Kit信号通路参与调节新生期小鼠肠道ICCs的存活,但是ICC-SM对该信号不敏感。3.阻断Kit信号通路,Kit~+ICCs和/或前体细胞的增殖完全停止,而抑制IGF-IR信号通路,增殖ICCs的细胞数量减少,证明ICCs的增殖依赖于Kit信号通路,而IGF-1R对ICCs增殖也具有一定的调控作用。4.停止Imatinib处理后,ICCs细胞数量迅速恢复正常,而增殖的Kit~+ICCs的数量较少且出现较晚。提示Kit阴性的ICCs前体细胞的增殖可能是大量增加的ICCs来源之一。上述结果表明新生期小鼠结肠的存活、增殖都依赖于Kit信号通路。当某些病理因素导致ICCs丢失时,Kit阴性的ICCs前体细胞可大量增殖分化为成熟的ICCs,维持肠道正常的生理功能。IGF-IR信号通路参与调节ICCs的增殖。综上所述,本研究初步证明出生后随结肠结构的不断完善ICCs亦可进一步发育。新生小鼠结肠ICCs具有增殖能力,且随年龄的增长逐渐降低消失。而增殖ICCs的主要来源可能是Kit~+/CD44~+/CD34~+/IGF-IR~+的ICCs前体细胞。Kit信号通路对ICCs的存活和增殖具有重要的调控作用,但是ICC-SM对Kit信号通路不敏感。