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第一章膝关节骨性关节炎患者滑液中硫化氢的动态变化及临床意义目的:检测膝关节液中硫化氢(H2S)的表达水平和膝关节内H2S合成酶的表达情况,分析并探讨其临床意义。方法:收集来青岛大学附属医院就诊的770例膝关节骨性关节炎患者的关节液及60名健康志愿者的膝关节液。采用亚甲基蓝分光光度计法测量H2S在膝关节滑液内的表达水平;采用免疫组化法检测膝关节软骨和滑膜中H2S合成酶的表达情况;比较骨性关节炎患者膝关节液中H2S含量变化与膝关节骨性关节炎影像学分期的关联性。结果:人膝关节液中表达H2S,健康志愿者膝关节液中H2S的平均值是45.72±5.33μM,骨性关节炎患者膝关节炎中H2S的平均值是29.02±5.54μM,两者之间的差距具有统计学意义(P<0.001)。骨性关节炎的症状越重,膝关节液中H2S的表达水平越低,经Spearman相关性分析发现:膝关节骨性关节炎患者关节液内H2S含量与影像学上膝关节炎的病变程度呈负相关(r=-0.795,p<0.001)。胱硫醚β合酶(CBS)、胱硫醚γ裂解酶(CSE)均在膝关节内表达。CBS在关节软骨细胞内表达较多,CSE主要在滑膜组织内表达。结论:人膝关节液中表达H2S,健康志愿者膝关节滑液内H2S表达水平高于骨性关节炎患者。骨性关节炎患者膝关节滑液内H2S的表达水平与膝关节骨性关节炎的影像学分期呈负相关。CBS主要在关节软骨中表达,而CSE主要在滑膜组织中表达。第二章H2S对兔膝关节骨性关节炎模型中关节软骨影响的实验研究目的:探讨H2S对兔膝关节骨性关节炎模型中关节软骨退变的影响。为H2S预防骨性关节炎的发生提供理论依据。方法:将32只新西兰大白兔随机分为四组,A组:空白对照组、B组:模型对照组、C组:H2S治疗组、D组:抑制H2S生成组,每组8只。A组不做任何处理,B、C、D组应用改良的Hulth法制作兔膝关节骨性关节炎模型。术后B组给予膝关节腔注射生理盐水,每周一次,连续6周。术后C组膝关节腔给予注射60μM的Na HS稀释液1ml,每周一次,连续6周。术后D组膝关节腔给予注射CBS酶抑制剂,每周一次,连续6周。术后7周处死动物。在处死动物之前,抽取膝关节液,采用Griess法及ELISA法分别检测关节液中NO和PGE2的含量。处死动物之后,切取关节软骨,行HE染色,光镜下根据Mankin’s关节软骨评分系统,进行评分,比较各组间差异;通过免疫组化的方法检测关节软骨中Ⅱ型胶原蛋白的表达情况;采用Real-time PCR的方法检测关节软骨中i NOS、COX-2、MMP-13 m RNA的表达情况。结果:光镜下:A组关节软骨形态正常;B组的关节软骨基质胶原纤维排列紊乱,关节退变严重;C组关节软骨退变程度降低;D组关节软骨退变程度加重。Mankin’s评分显示:同A组相比,B、C、D组评分均增加,差异具有统计学意义(P<0.05);H2S治疗后(C组)能够降低OA的Mankin’s评分,抑制H2S生成(D组)Mankin’s评分增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。骨性关节炎组(B组)关节液中NO、PGE2的表达增多;H2S治疗后(C组)能够降低OA关节液中NO、PGE2的表达量;抑制H2S生成(D组)OA关节液中NO、PGE2的表达量增加;差异具有统计学意义(P<0.05)。Ⅱ型胶原蛋白染色显示:同正常组(A组)相比,骨性关节炎组(B组)Ⅱ型胶原蛋白阳性染色显著降低,分布不均匀;H2S治疗后(C组)Ⅱ型胶原蛋白阳性染色增加,表达增多;抑制H2S生成(D组)Ⅱ型胶原蛋白阳性染色显著降低且表浅层出现缺损;差异具有统计学意义(P<0.05)。H2S治疗后,与模型对照组比较,关节软骨中i NOS、COX-2、MMP-13 m RNA的表达降低;抑制H2S生成后,i NOS、COX-2、MMP-13 m RNA的表达增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.H2S抑制兔骨性关节炎的膝关节液中NO与PGE2的生成。2.H2S抑制兔骨性关节炎的关节软骨中的Ⅱ型胶原纤维的降解。3.H2S抑制兔骨性关节炎的关节软骨中的i NOS、COX-2、MMP-13m RNA的表达。第三章硫化氢通过NF-κB途径抑制IL-1β诱导的软骨细胞损伤目的:研究硫化氢对IL-1β诱导软骨细胞损伤的保护作用机制。方法:通过IL-1β刺激软骨细胞来模拟骨性关节炎的体内炎症状态。软骨细胞预先经不同浓度的硫化氢(0.06–1.5 m M)处理,然后给予IL-1β(10 ng/ml)处理。通过Griess检测试剂盒检测NO的表达情况,酶联免疫吸附法检测PGE2及MMP-13的表达情况;通过荧光定量聚合酶链反应检测i NOS、COX-2、MMP-13的基因表达情况;丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路及细胞核因子-κB(NF-κB)信号通路的调节作用采用Western blot的方法检测。结果:IL-1β诱导软骨细胞表达i NOS、COX-2、MMP-13的m RNA,从而增加软骨细胞分泌NO、PGE2和MMP-13。硫化氢抑制IL-1β对软骨细胞的这种损伤作用。IL-1β促进MAPKs通路中的ERK1/2磷酸化及NF-κB通路中的iκBα磷酸化和NF-κB(P65)的核转移。硫化氢能够抑制ERK、Ik Bα、NF-κB(P65)的磷酸化。结论:硫化氢可通过抑制ERK-ik Bα-NF-κB(P65)通路的激活保护IL-1β诱导的软骨细胞损伤,从而延缓骨性关节炎的进程。