动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种脂代谢异常驱动的慢性血管炎症疾病,严重威胁人类健康。大量研究表明,巨噬细胞在AS发生/发展过程中,发挥了关键调控作用。自噬是细胞对脂质代谢的重要途径,自噬障碍导致细胞脂质积累,诱导巨噬细胞泡沫化,进而引起AS。课题组前期从海带中分离纯化获得了一种抗AS活性的多糖均一组分LJP61A,并阐明了其化学结构。本论文以此为基础,采用高脂饮食诱导LDLr-/-小鼠AS和Ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化为活性评价模型,以细胞自噬为切入点,研究了LJP61A干预AS的调控机制。通过研究,主要获得如下实验结果:血管巨噬细胞自噬对LJP61A干预动脉粥样硬化的动态响应。高脂饲料喂养LDLr-/-小鼠,建立不同时期（4、8、16、24周）的AS模型,研究血管巨噬细胞自噬对LJP61A干预AS的动态响应。研究发现,与高脂组相比,LJP61A不仅显著降低了小鼠体重、附睾脂肪重量、肝体指数、血清中LDL-C、TC、TG、apoB、NEFA、葡萄糖与TC/HDL-C水平,而且显著抑制了肝脏脂质沉积。病理学观察显示LJP61A有效抑制高脂饮食引起的粥样斑块形成和单核巨噬细胞向血管浸润。Western blot和qRT-PCR结果表明,与模型组相比,LJP61A显著抑制了血管ERK1/2、JNK、p38、Akt和p65的磷酸化、下调了TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的mRNA水平、同时提高了IκB-α的蛋白表达,表明LJP61A有效缓解了高脂饮食诱导的小鼠AS病变进展和炎症反应;同时还发现,LJP61A在干预AS进程中,伴随了ATG5与LC3II蛋白水平的升高、自噬底物p62蛋白水平的降低、主动脉单核巨噬细胞MOMA-2与LC3共定位荧光强度增强。这些结果暗示,LJP61A可能是通过调控血管巨噬细胞的自噬活性,进而抑制AS的发生与发展。LJP61A对巨噬细胞自噬的调控作用。采用Ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化模型,研究LJP61A调控的自噬对巨噬细胞泡沫化的影响。与模型组相比,LJP61A显著抑制了Ox-LDL诱导巨噬细胞向泡沫化细胞转化,下调了脂质吸收/转化基因表达（CD36、ACAT1）,上调了脂质代谢基因LXR-α表达,提高了胆固醇向HDL和apoA-I的流出率,降低了细胞内胆固醇酯浓度。Western blot和qRT-PCR结果表明,LJP61A显著抑制了p65、ERK1/2、JNK、p38和Akt蛋白的磷酸化,下调了TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平,上调了IκB-α的蛋白表达和IL-10 mRNA水平。表明LJP61A能改善Ox-LDL引起的脂质吸收与清除间的不平衡及炎症反应。同时还发现,LJP61A在抑制巨噬细胞泡沫化的过程中,伴随了胞内自噬体数量增加、ATG5与LC3II蛋白水平提高、p62蛋白水平下调、溶酶体相关蛋白LAMP1与Cathepsin D水平提高,改善了Ox-LDL损伤的自噬流。这些结果暗示,LJP61A可能是通过调节自噬抑制巨噬细胞泡沫化。此外,LJP61A可以促进自噬体选择性靶向脂滴增多（LC3+Bodipy+）、自噬体与溶酶体有效融合（LC3+Lyso-Tracker-Red+）、脂滴与溶酶体的互作（Bodipy+Lyso-Tracker-Red+）,促进脂滴自噬。在此基础上,进一步采用ATG5 siRNA、Chloroquine、Leupeptin分别抑制自噬的启动、自噬体与溶酶体融合、溶酶体降解阶段。三种抑制剂不仅显著削弱了LJP61A对巨噬细胞自噬的促进作用,而且大幅降低了LJP61A对脂滴自噬的刺激作用,加剧细胞内脂质沉积。表明LJP61A可通过调节脂滴自噬抑制巨噬细胞泡沫化。用高脂饮食喂养LDLr-/-小鼠,LJP61A灌胃干预4周后,将含有[3H]-胆固醇的荷脂巨噬细胞注射到小鼠腹腔。研究发现,与高脂组相比,LJP61A显著提高了小鼠血浆、肝脏、胆囊和粪便中的[3H]-胆固醇,增加了小鼠主动脉ABCA1、ABCG1的蛋白表达,上调了血清中HDL-C和apoA-I水平。表明LJP61A在体内促进了巨噬细胞的胆固醇逆向转运效率。综合上述结果,LJP61A可能是通过改善Ox-LDL损伤的自噬流和脂滴自噬,减少巨噬细胞内脂质积聚,从而抑制血管巨噬细胞向泡沫细胞转化。另外,LJP61A调节的脂噬作用,进一步在体内促进了巨噬细胞中脂滴相关的胆固醇逆向转运,最终抑制了AS的发生和发展。LJP61A对巨噬细胞自噬的调控机制。采用Ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化模型,进一步研究LJP61A通过调节自噬抑制巨噬细胞泡沫化的调控机制。研究发现,LJP61A在抑制巨噬细胞泡沫化的过程中,显著上调了AMPK的磷酸化和TFEB的去磷酸化,下调了mTOR的磷酸化,表明LJP61A显著调控了AMPK-mTOR-TFEB信号通路。在此基础上,分别使用AMPK与mTORC1的抑制剂AMPK siRNA和Rapamycin处理细胞,证实LJP61A通过调控AMPK-mTOR信号途径,增加了TFEB核转位,上调了GFP-LC3阳性细胞数、自噬体数以及ATG5、LC3-II、LAMP1、Cathepsin D、ABCA1和ABCG1的蛋白水平,促进了自噬体选择性靶向脂滴、自噬体与溶酶体有效融合、脂滴与溶酶体的互作、自噬底物蛋白p62的降解以及自噬流,提高了胆固醇向HDL和apoA-I的流出率,从而抑制泡沫细胞的形成。体内试验证明,在不同时期的AS小鼠中,LJP61A通过AMPK-mTOR-TFEB途径促进小鼠血管巨噬细胞的自噬活性,抑制AS的发生与发展。细胞自噬介导LJP61A调控巨噬细胞极化。采用Ox-LDL诱导巨噬细胞极化模型,研究LJP61A调控的自噬对巨噬细胞极化的影响。与模型组相比,LJP61A显著减少Ox-LDL诱导的巨噬细胞脂质沉积,降低CD86、iNOs、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β等M1型巨噬细胞标志因子的表达,提高M2型巨噬细胞标志因子（CD206、Arg1、IL-10）的表达,从而降低M1/M2型巨噬细胞表型比例。同时,LJP61A在调节巨噬细胞极化的过程中,伴随了自噬流的增强。3-MA是一种自噬抑制剂。这种抑制剂阻断了LJP61A对巨噬细胞极化的影响。SIRT1和FoxO1是控制自噬行为的两个关键上游基因。我们还发现,与模型组相比,LJP61A显著上调了SIRT1和FoxO1的表达。然而,LJP6A对自噬、巨噬细胞极化与泡沫化的调控效应,被SIRT1 siRNA和FoxO1抑制剂AS1842856所消除。体内实验证明在进展期动脉粥样硬化小鼠(LDLr-/-)中,LJP6A通过调节SIRT1-FoxO1信号通路,提高主动脉自噬活性,调节血管巨噬细胞向M2表型极化,缓解AS进程。上述研究表明,LJP61A通过调节细胞自噬,导致巨噬细胞向M2表型极化,抑制巨噬细胞泡沫化,进而干预AS的发生发展。