竹黄是我国民间传统的一种寄生型药用真菌,研究发现其子实体中主要的活性物质为竹红菌素,具有抗菌、抗癌、抗HIV等多种药理学活性。由于野生竹黄资源受到各种因素的限制,无法满足大规模临床试验和工业化应用的需求,因此通过微生物发酵来提高竹红菌素的产量成为当前研究的热点。本论文以一株来源于蛇足石杉的内生真菌Shiraia sp.Slf14为研究对象,通过外源金属离子的添加来进一步提高苝醌类化合物的产量,并研究了钙信号调控Shiraia sp.Slf14合成苝醌类化合物的分子机制,旨在为苝醌类化合物生物合成机制研究提供资料,而且可为将来苝醌类化合物的组合生物合成研究奠定基础。主要结论如下:(1)通过液态发酵过程中添加不同种类的金属离子来确定金属离子对Shiraia sp.Slf14合成苝醌类化合物的影响,研究发现K+、Na+、Ca2+的添加有利于苝醌类化合物的合成,Cu2+、Zn2+、Fe3+极显著的抑制苝醌类化合物的合成。在发酵第4 d,向培养基中添加6 g/L的CaCl2,苝醌类化合物的总量在发酵结束时高达1894.66±21.93 mg/L,相对于对照提高4.83倍,5种苝醌类化合物单体(EA、EB、EC、HA和HB)的含量分别提高了5.39、3.77、7.44、4.76和2.09倍。(2)通过发酵过程中添加钙调蛋白抑制剂氯丙嗪和钙调磷酸酶抑制剂他克莫司来研究钙信号是否调控苝醌化合物的合成。实验发现1 mM氯丙嗪和10μM他克莫司能显著抑制苝醌类化合物的合成,在回补钙离子的条件下,抑制剂对苝醌类化合物总量和5种单体含量的抑制作用又有一定程度的解除。这初步表明钙离子可能是通过钙信号来调控苝醌类化合物物的合成。为了进一步了解胞内钙离子、钙信号和苝醌类化合物之间的关系,我们研究了发酵过程中胞内钙离子的动态变化。添加钙离子后,菌体内的钙离子含量始终维持在一个较高的水平;在添加抑制剂的条件下,胞内钙离子的含量显著降低;当培养基中同时添加抑制剂和钙离子的条件下,胞内钙离子含量相对于只添加抑制剂时增加。结合不同培养条件下菌体内苝醌类化合物的积累量,初步证明钙离子是通过引发钙信号来调控苝醌类化合物的生物合成。(3)为了进一步验证钙信号调控苝醌类化合物的合成,我们检测了发酵过程中钙感应蛋白和苝醌类化合物合成基因的转录水平的变化。研究结果表明,钙离子的添加能诱导钙号中3个关键的钙感应蛋白(cam、cna和crz1)和苝醌类化合物合成关键基因(PKSⅠ、omef和hyd)的转录水平都显著上调。然而在添加抑制剂的条件下,这些基因的转录水平都显著下调。当培养基中同时添加抑制剂和钙离子时,这些基因的转录水平相对于只添加抑制剂的情况,都有不同程度的恢复。不同添加条件下菌体内苝醌类化合物总量和各组分的变化情况表明,钙离子是通过上调钙信号转导过程中相关基因和苝醌类化合物合成基因的转录水平来提高苝醌类化合物的总量及各组分的含量。本论文提供了一种简单有效的策略来提高苝醌类化合物的含量,并对其具体作用机制进行了初步研究,这将为苝醌类化合物的代谢调控奠定基础。