背景和目的:世界上约1/3人口感染过结核杆菌,2007年全球估计有1300万结核病患者,而中国结核病患者约占17%,仅次于印度。日益严峻的结核耐药形势危机社会公共卫生安全,目前学术界、政府机构关注焦点集中于肺结核,骨关节结核耐药所占比例小,没有获得足够的关注。骨关节结核虽然比例小,但基于中国结核病负担重、人口基数大,骨关节结核将越来越常见,应引起骨科医师的重视。自1963年发明利福平用于抗结核治疗以来,大大缩短了结核病疗程,成为联合化疗的基石。但系列研究表明利福平口服生物利用度差,血浆中药物浓度较低。脊柱结核病理特殊,有脓液、干酪组织、死骨、硬化骨等病变,血供差,口服用药难以保证病灶区内足够的药物浓度。提高病灶内药物浓度可能增强其杀菌效果,为维持病灶内有效药物浓度,缓控释制剂成为研究焦点。因此,本实验主要目的包括(1)筛选一种抗结核药物用于脊柱结核局部缓释;(2)冷冻干燥同种异体骨复合纤维蛋白多聚体作为抗结核药物缓释载体,制备一种新型植入型缓释系统;(3)体内外评价植入型抗结核药物缓释系统的特性。内容与方法:(1)骨关节结核病灶结核杆菌培养、药敏试验:纳入72例骨关节结核患者,通过液体培养基及BACT/ALERT 3D系统进行结核分枝杆菌快速培养,培养阳性者接种L-J培养基,按绝对浓度法进行药敏试验,研究分析重庆地区骨关节结核耐药流行情况,以选用耐药率较低的药物;(2)骨关节结核病灶利福平、异烟肼浓度检测:分别建立高效液相法检测利福平、异烟肼条件,检测36例骨关节结核患者病灶内利福平和异烟肼药物浓度,以明确局部用药的必要性;(3)高浓度利福平对耐利福平结核分枝杆菌杀菌效果测定:复苏18株利福平耐药菌株,采用微阵列基因芯片检测rpoB基因突变,研究递增浓度利福平(2,4,8,16,32,64,128,256μg/ml)对耐利福平菌株杀菌效果,并分析rpoB基因突变与利福平耐药度相关性。(4)山羊冷冻干燥同种异体骨支架材料的制备:遵守美国组织库协会(AATB)标准,制备山羊冷冻干燥同种异体髂骨及松质骨,扫描电镜观察微观结构,测量孔隙率及密度;(5)选用纤维蛋白多聚体固定利福平晶体,优化其配方:采用正交试验设计,组成9种纤维蛋白胶组成配方(纤维蛋白原3个浓度,凝血酶3个浓度,氯化钙40mg/ml,氨甲环酸10mg/ml),制备纤维蛋白胶圆饼,甲醇作为利福平溶剂,将利福平晶体分布于纤维蛋白多聚体网络结构内,体外缓释优化纤维蛋白胶配方;(6)负压灌注法制备植入型利福平缓释系统:进一步研制负压灌注系统,依次将配方优化后纤维蛋白多聚体和利福平灌入松质骨孔隙内,制备植入型利福平缓释系统,扫描电镜观察其微观结构,测定载药量、载药率。(7)植入型利福平缓释系统体外缓释参数及抗结核活性:山羊血清作为体外缓释分散介质,37℃避光,定期换液取样,高效液相色谱法检测其缓释特性;结核分支杆菌标准菌株接种液体培养基,体外检测3种植入型利福平缓释系统抗结核能力。(8)利福平对MSCs增殖和成骨分化的影响:分离、培养人骨髓来源间充质干细胞,培养基内加入梯度浓度(4-128ug/ml)利福平,定期(1、3、5、7d)显微镜观察、MTT法检测不同浓度利福平对MSCs增殖的影响;成骨诱导28天,茜素红染色、骨钙素染色、real-time RT-PCR及western blot检测不同浓度利福平对MSCs成骨指标的影响;(9)植入型利福平缓释系统体内缓释研究:建立山羊体内评价模型,将植入型利福平缓释系统分别置入椎间、髂骨内缺损处,髂骨处定期抽液,高效液相色谱法评价植入型利福平缓释系统体内缓释特性,并利用大体观察、X线片、CT三维重建、组织病理学评估植入型利福平缓释系统椎间植骨成骨融合效果。研究结果:(1)骨关节结核病灶结核杆菌培养、药敏试验:72例中培养阳性31例(43.1%),其中人型结核杆菌28例,牛型结核杆菌3例。全部敏感16例,耐药15例,其中耐1种药物8例,耐2种药物5例,耐4种药物1例,耐5种药物1例。耐药种类:异烟肼耐药8例,利福平均耐药2例,链霉素耐药4例,乙胺丁醇耐药2例,力克肺疾耐药2例,左氧氟沙星耐药9例;(2)骨关节结核病灶利福平、异烟肼浓度检测: 6例能维持利福平有效杀菌浓度4.60±0.76 ug/ml,7例检测不到,其余23例患者低于有效杀菌浓度,平均0.78±0.45ug/ml;异烟肼浓度:34例患者结核病灶异烟肼浓度平均0.543±0.132(0.332-0.704)ug/ml,达到有效杀菌浓度。(3)高浓度利福平对耐利福平结核分枝杆菌杀菌效果测定:18株利福平耐药菌株中有17株(94.4%)检测到rpoB基因突变,1例未检测到突变。突变位点位于531 (55.56%), 526 (11.11 %), 516 (16.67 %) and 513 (11.11%);与低水平耐药相比,高水平耐药(250μg/ml )出现531-Ser突变较高。11例MIC超过256μg/ml(超过设计浓度高限,故未检测),其余7株结核杆菌MICs为32-256μg/ml,特别是低水平耐药者多可被较高浓度利福平杀灭、抑制。(4)山羊冷冻干燥同种异体骨支架材料的制备:冷冻干燥同种异体髂骨支架材料呈乳白色,质硬,具有骨组织天然三维网状孔隙,孔隙内洁净,相互连通。密度为0.39±0.03 g/ml ,孔隙率61.23±9.12%。孔径293±23.2 (188～487)um,皮质骨厚度1.59±0.16 (1.09～2.08)mm。(5)选用纤维蛋白多聚体固定利福平晶体,优化其配方:在9组正交实验中, 3、5、8号纤维蛋白胶配方三维网状结构与利福平颗粒均匀交替分布,这3组虽有突释现象,但缓释曲线较平稳,能维持较高的利福平浓度,49天时其浓度分别为6.22、8.23、7.63 ug/ml。(6)负压灌注法制备植入型利福平缓释系统:采用3、5、8号配方制备3组植入型利福平缓释系统,外观呈鲜红色,药物分布均匀,纤维蛋白胶将骨块孔隙封闭。扫描电镜可见纤维蛋白胶将骨块孔隙封闭,纤维蛋白胶将利福平晶体固定于孔隙表面和内部。(7)植入型利福平缓释系统体外缓释参数及抗结核活性: 8号配方仍有突释,3、5号配方突释现象有明显改善,缓释曲线平稳。3号配方可维持有效杀菌浓度42天,49天时检测不到。5号配方至少可维持49天。三组均可有效杀灭结核杆菌标准菌株。(8)利福平对MSCs增殖和成骨分化的影响:0-16 ug/ml利福平与MSCs具有良好的相容性,对其增殖无明显影响;利福平浓度≥32ug/ml明显抑制MSCs增殖;0-8 ug/ml利福平对MSCs成骨诱导分化无明显影响,利福平浓度≥16ug/ml明显抑制MSCsⅠ型胶原、骨桥蛋白、碱性磷酸酶表达;(9)植入型利福平缓释系统体内缓释评价:植入型利福平缓释系统体内缓释时,随时间延长局部成骨环境内利福平浓度逐渐降低,维持利福平有效杀菌浓度超过42天,浓度为13.55ug/ml,49天时利福平浓度为2.23 ug/ml。术后9月实验组与对照组均达到骨性融合。结论:1、结核杆菌快速培养联合绝对浓度法药敏试验准确度高,费用低,可检测常用一线、二线药物敏感性,适用于指导骨关节结核患者个体化化疗方案的制定;骨关节结核利福平耐药率相对较低;2、部分患者骨关节结核病灶中利福平难以维持有效杀菌浓度;3、高浓度利福平抑制MSCs增殖、成骨分化,为植入型利福平缓释系统的参数优化提供了安全指标;4、优化配方制备的植入型利福平缓释系统体外缓释曲线较平稳,能维持有效杀菌浓度至少49d;体外抗结核作用可靠;5、植入型利福平缓释系统可维持体内局部有效杀菌浓度至少42d,无明显全身毒性,不影响最终骨性融合。