乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。根据GLOBOCAN测算,乳腺癌占所有癌症病例的23%,并且构成了癌症死亡人数中的14%。因为肿瘤进展迅速和早期转移,即使运用多种手段治疗,大多数晚期癌症病人的预后都不理想。乳腺癌病因复杂,与遗传因素、激素、免疫及各种环境因素有关。乳腺癌是一种多基因变异引起的疾病,发生发展的不同阶段具有不同的基因表达改变,这些基因表达的改变影响着乳腺癌细胞的生物学行为和乳腺癌的临床表征。基因表达水平的改变和基因突变/重排都影响着基因的调节功能。细胞原癌基因的活化和抑癌基因的抑制/失活在乳腺癌的发生发展中发挥着重要作用。进一步研究和阐明乳腺癌发生发展中的分子机制,对理解乳腺癌的发病机理和乳腺癌的临床诊断治疗具有非常重要的意义。JMJD2A属于JMJD2蛋白家族,拥有JmjN,JmjC和2个串联的PHD锌指结构、Tudor结构域,分子量为130KD。JmjC结构域被认为是JMJD2家族发挥酶学功能的主要功能区,可以发挥去甲基化酶的催化功能,从而打破组蛋白甲基化和去甲基化状态的平衡。PHD锌指结构和Tudor结构域则可能参与蛋白-蛋白相互作用,与一些转录因子结合而导致染色质重构,其中染色质重构复合物中尤以组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase, HDAC)最常见而最重要。JMJD2A广泛的表达于人体癌组织和细胞系中,如肺癌,膀胱癌和前列腺癌。在某些人类细胞类型中,JMJD2A信使RNA出现内源性的高表达,包括人嗜T淋巴细胞病毒1感染的细胞系,HT1376膀胱癌细胞系,U2OS骨肉瘤细胞系和前列腺癌细胞系。JMJD2A可结合组蛋白去乙酰化酶HDACs,而组蛋白去乙酰化被认为可抑制基因转录,因此JMJD2A可能通过促进组蛋白去乙酰化而发挥了抑制基因转录的功能。JMJD2A在结构和功能上可与pRb、E2F以及HDAC结合,形成复合物而抑制下游基因的表达。在这个过程中,E2F-HDAC扮演重要角色,抑制众多下游基因表达,其中抑癌基因ARHI是很重要的一种。由于JMJD2A在人体广泛表达,并且与各种肿瘤的发生发展具有相关性,而现有的文献尚未报道JMJD2A在人体乳腺癌组织中是否存在表达异常,JMJD2A的表达与乳腺癌的发生发展是否具有相关性,如果存在相关性,JMJD2A通过何种途径参与调控乳腺癌的发生发展。本研究拟从这三个方面入手,对JMJD2A参与人乳腺癌发生发展的功能及机制进行研究。第一部分JMJD2A在人乳腺癌组织中表达及与ARHI,p53,ER,PR和CerbB-2相关性研究背景JMJD2A广泛的表达于人体癌组织和细胞系中,但是尚未有文献报道JMJD2A与乳腺癌的联系。本部分研究致力于检测JMJD2A在人乳腺癌中的表达情况,并且更进一步调查JMJD2A与ARHI,p53,ER,PR和CerbB-2肿瘤相关蛋白之间的关系。方法收集人乳腺癌样本104例,纤维腺瘤样本60例。使用HE染色组织学检查验证样本的医院临床病理诊断。分别使用免疫组化检测,蛋白印迹法和实时定量PCR检测乳腺癌组织和良性病变组织中JMJD2A的表达情况。使用免疫组化检测和实时定量PCR检测乳腺癌组织中ARHI,p53,ER,PR和CerbB-2的表达情况,并使用SPSS软件软件分析它们与JMJD2A的相关性。结果样本的临床诊断都是准确的。免疫组化结果显示104例浸润型导管癌组织样本由22例强阳性(21.2%),34例阳性(32.7%),30例弱阳性(28.8%)和18例阴性(16.7%)构成。60例纤维腺瘤组织样本免疫组化结果由2例强阳性(3.3%),5例阳性(8.3%),6例弱阳性(10.0%)和47例阴性(78.3%)构成。蛋白印记法显示,浸润型导管癌组织中JMJD2A蛋白的平均光密度为1.094±0.151,纤维腺瘤组织中JMJD2A为0.563±0.105,浸润型导管癌中JMJD2A蛋白的表达显著高于纤维腺瘤组织。实时定量PCR显示,信使RNA在浸润型导管癌组织中相对表达量为0.621±0.117,显著高于在纤维腺瘤组织中的相对表达量0.286±0.105。Spearman和Pearson相关性分析显示,JMJD2A与ARHI表达呈负相关,与p53和ER表达呈正相关。结论JMJD2A的表达被从原位,蛋白表达水平和信使RNA表达水平三个方面证实在人乳腺癌组织标本中显著高于在良性病变组织中。并且,通过统计学软件分析,在浸润型导管癌组织中,JMJD2A与抑癌基因ARHI的表达呈负相关,与p53和ER的表达呈正相关。第二部分JMJD2A与高侵袭性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的相关性研究背景第一部分研究已经证实JMJD2A在人乳腺癌组织标本中的高表达,但是尚未能够说明其与乳腺癌的相关性,需要进一步的实验验证。使用小干扰RNA来使靶基因沉默具有简单,特异性高和效率高的特点,近年来被广泛使用。本部分实验运用小干扰RNA沉默JMJD2A基因,观察癌细胞生物学行为的变化。方法用化学合成的JMJD2A特异性的小干扰RNA转染进入人乳腺癌细胞系MDA-MB-231siRN A组,同时设阴性对照组(使用转染试剂和阴性对照siRNA)和空白对照组(只加培养基)。使用实时定量PCR和蛋白印迹法检测三组细胞JMJD2A在信使RNA和蛋白水平的表达。使用流式细胞术和MTT检测法检测三组细胞细胞周期和增殖能力。使用Transwell小室迁移和侵袭实验检测三组细胞迁移和侵袭能力的变化。结果转染效率达到72.3%。实时定量PCR结果显示,siRNA组JMJD2A信使RNA相对表达量为0.386±0.108,空白组为0.998±0.170,阴性对照组为0.997±0.150。蛋白印迹法结果显示,siRNA组JMJD2A蛋白的平均光密度为0.093±0.051,空白组中为0.203±0.042,阴性对照组中为0.210±0.050。流式细胞术检测结果显示,siRNA组中处于G0/G1期的细胞百分率为44.3±1.6%,分别显著高于空白组处于G0/G1期的细胞百分率30.3±2.7%和阴性对照组处于G0/G1期的细胞百分率34.2±2.3%；siRNA组中处于S期的细胞百分率为43.44±2.3%,分别显著低于空白组处于S期的细胞百分率58.4±2.1%和阴性对照组处于S期的细胞百分率52.8±2.2%。然而,siRNA组中处于G2/M期的细胞百分率为12.1±2.2%,与空白组处于G2/M期的细胞百分率11.0±1.2%和阴性对照组处于G2/M期的细胞百分率13.3±1.8%无明显差异。进一步计算增殖指数,发现siRNA组的增殖指数55.6±2.1%,分别明显低于空白对照组的69.6±2.1%和阴性对照组的65.9±2.2%。MTT检测结果显示,siRNA组的平均实际吸光度为1.711±0.087,显著低于空白对照组和阴性对照组的平均实际吸光度分别是2.136±0.135和2.089±0.115。Transwell小室迁移和侵袭实验结果显示,迁移实验中,siRNA组的穿膜细胞数为67±10.2,分别显著的低于空白对照组的173±17.7和阴性对照组的168±16.4；侵袭实验中,siRNA组的穿膜细胞数为175±14.4,分别显著的低于空白对照组的327±20.8和阴性对照组的311±15.3。结论我们进行的细胞实验证明在高侵袭性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中转染JMJD2A特异的小干扰RNA能够下调JMJD2A信使RNA表达水平致其沉默,能够抑制JMJD2A蛋白的表达。在高侵袭性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中瞬时转染JMJD2A特异的小干扰RNA实验手段是成功的。进而能够导致细胞周期改变和增殖抑制,以及能够抑制细胞迁移和侵袭能力。本部分研究证明了在人乳腺癌组织中,沉默JMJD2A基因能够抑制癌细胞恶性生物学行为,JMJD2A在人乳腺癌的高表达不是一种偶然,而是与癌细胞生物学行为具有相关性的。第三部分JMJD2A与低侵袭性人乳腺癌细胞系MCF-7的相关性研究背景前两部分的研究已经证实JMJD2A在人乳腺癌组织标本高表达,证明JMJD2A与癌细胞生物学行为具有相关性。在高侵袭性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中转染JMJD2A特异的小干扰RNA能够下调JMJD2 A信使RNA表达水平致其沉默,能够抑制JMJD2A蛋白的表达,进而能够导致细胞周期改变和增殖抑制,以及能够抑制细胞迁移和侵袭能力。转染是有效的。但是仅仅只证明JMJD2A与高侵袭性的MDA-MB-231乳腺癌细胞系的相关性是有瑕疵的,无法代表各种类型的乳腺癌细胞,因此仍需对其他的乳腺癌细胞系进行实验,以完整JMJD2A与乳腺癌相关性的研究。低侵袭性的MCF-7细胞系与高侵袭性的MDA-MB-231细胞系能够模仿乳腺癌在体内的表达模式,因此选用MCF-7细胞系能够有效的对第二部分进行补充。方法在这部分研究中,我们改为使用低转移性的MCF-7人乳腺癌细胞系。用化学合成的JMJD2A特异性的小干扰RNA转染进入人乳腺癌细胞系MCF-7siRN A组,同时设阴性对照组(使用转染试剂和阴性对照siRNA)和空白对照组(只加培养基)。使用实时定量PCR和蛋白印迹法检测三组细胞JMJD2A在信使RNA和蛋白水平的表达。使用流式细胞术和WST-8检测法检测三组细胞细胞周期和增殖能力。使用Transwell小室迁移和侵袭实验检测三组细胞迁移和侵袭能力的变化。结果转染效率达到70.4%。实时定量PCR结果显示,siRNA组JMJD2A信使RNA相对表达量为0.55±0.03,空白组为0.98±0.02,阴性对照组为0.94±0.03。蛋白印迹法结果显示,siRNA组JMJD2A蛋白的平均光密度为0.083±0.031,空白组中为0.223±0.053,阴性对照组中为0.208±0.047。流式细胞术检测结果显示,siRNA组中处于G0/G1期的细胞百分率为53.80±1.80%,分别显著高于空白组处于G0/G1期的细胞百分率44.24±1.86%和阴性对照组处于G0/G1期的细胞百分率46.37±1.29%；siRNA组中处于S期的细胞百分率为36.55±1.52%,分别显著低于空白组处于S期的细胞百分率47.06±1.26%和阴性对照组处于S期的细胞百分率44.72±1.86%。然而,siRNA组中处于G2/M期的细胞百分率为9.64±1.26%,与空白组处于G2/M期的细胞百分率8.70±0.63%和阴性对照组处于G2/M期的细胞百分率8.58±1.35%无明显差异。进一步计算增殖指数,发现siRNA组的增殖指数46.19±1.80%,分别明显低于空白对照组的55.76±1.86%和阴性对照组的53.63±1.29%。MTT检测结果显示,siRNA组的平均实际吸光度为1.45±0.05,显著低于空白对照组和阴性对照组的平均实际吸光度分别是1.73±0.02和1.69±0.03。Transwell小室迁移和侵袭实验结果显示,迁移实验中,siRNA组的穿膜细胞数为57±11.3,分别显著的低于空白对照组的114±19.5和阴性对照组的109±18.7；侵袭实验中,siRNA组的穿膜细胞数为133±17.4,分别显著的低于空白对照组的197±20.6和阴性对照组的181±16.3。结论我们进行的细胞实验证明在低侵袭性人乳腺癌细胞系MCF-7中转染JMJD2A特异的小干扰RNA也能够下调JMJD2A信使RNA表达水平致其沉默,能够抑制JMJD2A蛋白的表达,进而能够导致细胞周期改变和增殖抑制,以及能够抑制细胞迁移和侵袭能力。在第一部分和第二部分实验结果的基础上,证明了对无论高侵袭性还是低侵袭性的乳腺癌细胞系,瞬时转染JMJD2A特异的小干扰RNA都能使JMJD2A沉默,都能够有效的抑制其增殖、迁移和侵袭的恶性生物学行为。JMJD2A与人乳腺癌的发生发展之间的相关性是一种共性。第四部分JMJD2A参与抑癌基因ARHI调控机制的研究背景前三部分实验研究已经证明,JMJD2A在人乳腺癌中高表达,JMJD2A与人乳腺癌的发生发展相关。第一部分发现JMJD2 A与ARHI表达呈负相关。抑癌基因ARHI在人乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤中呈现被抑制的状态。JMJD2A能够与HDAC1、HDAC3和pRb等蛋白相互作用。研究表明E2Fs与ARHI表达呈负相关性,HDACs也被表明参与ARHI的表达负调节。我们推测ARHI可能是JMJD2A的调节靶基因,JMJD2A能够调控ARHI的表达。但是调控机制仍需要进一步探索。方法本部分实验对成对的乳腺癌组织和癌旁非肿瘤组织中JMJD2A和ARHI进行蛋白印迹法测定。对乳腺癌组织和非乳腺癌组织的连续切片进行JMJD2A和ARHI免疫组化染色。通过实时定量PCR和蛋白印迹法检测转染JMJD2A特异性siRNA后JMJD2A和ARHI在mRNA和蛋白水平的表达。使用免疫共沉淀方法确定JMJD2A结合的蛋白。通过染色质共沉淀方法确定JMJD2A是否与ARHI启动子区域结合。结果蛋白印迹分析实验显示,JMJD2A高表达的人乳腺癌组织样本中ARHI呈现低表达状态,对应的癌旁的非人乳腺癌组织样本中JMJD2A的表达低于人乳腺癌组织样本,同时ARHI的表达也高于人乳腺癌组织样本中。免疫组化染色结果显示,两种组织中JMJD2 A染色阴性的切片呈现ARHI染色阳性,而人乳腺癌组织样本中JMJD2A染色阳性的切片呈现ARHI染色阴性。沉默JMJD2A基因后,在两种细胞系ARHI在mRNA和蛋白水平表达都增加。JMJD2A能够与E2Fs和HDACs免疫共沉淀。JMJD2A能够免疫沉淀ARHI启动子区域的A1位点和A2位点。结论我们验证了JMJD2A 与 ARHI表达的负相关性,在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7中转染沉默JMJD2A基因能够导致抑癌基因ARHI的表达增加。JMJD2 A确实能够与HDACs和E2Fs特异性的结合形成复合物。JMJD2A能够特异性的结合到ARHI的启动子区域,发挥负性调节作用。阐明了JMJD2A通过负性调节ARHI的表达促进乳腺癌的发生发展的机制。