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作为疱疹病毒目(Herpesvirales)疱疹病毒科(Herpesvirales)α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)马立克病毒属(Mardivirus)的一员,鸭瘟病毒(Duck plague virus, DPV)是一种泛嗜性全身性感染病毒,主要引起鸭、鹅、天鹅等雁形目水禽的急性接触性传染病——鸭瘟。该病以血管损伤、组织出血、消化道黏膜糜烂、淋巴器官出现病变及实质器官的退行性变化为特征,是影响水禽养殖业的重要疫病。目前,主要依靠接种灭活疫苗和鸡胚化弱毒苗来预防鸭瘟的发生。灭活疫苗安全性好,但免疫维持期短、剂量较大、成本较高；鸡胚化弱毒苗虽然免疫效果较好,但是存在毒力返强和隐性带毒等安全隐患,而且现有的诊断方法无法区别自然感染野毒和弱毒疫苗免疫的动物。因此,研制更为安全有效的新型基因工程疫苗具有重要的理论和应用价值。生物信息学分析表明鸭瘟病毒糖蛋白C (glycoprotein C, gC)在不同毒株间高度保守,原核表达结果显示gC具有良好的免疫原性。因此,本研究选择gC基因作为保护性抗原基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)以构建鸭瘟病毒gC基因疫苗。酶切分析和间接免疫荧光法证实gC基因正确插入并能够在COS7细胞中表达。为了大量获取构建的真核表达质粒,本研究初步摸索了该质粒高密度发酵的条件,随后进行了质粒大抽和纯化,分光光度计、酶切分析和琼脂糖电泳结果表明获得的质粒杂质少、超螺旋结构含量达90%以上。为了阐明免疫佐剂及免疫途径对鸭瘟病毒gC基因疫苗的影响,本研究应用gC特异的基于TaqMan探针的定量PCR分析脂质体/gC基因疫苗复合物及壳聚糖/gC基因疫苗复合物通过肌注、口服、滴鼻等途径进入鸭体内后在各组织器官的分布规律,同时与基因枪轰击和肌注裸质粒不同剂量进行比较。试验结果表明脂质体和壳聚糖能够有效提高鸭瘟病毒gC基因疫苗在鸭体内的分布,而基因枪轰击的转染效率最高,口服有利于基因疫苗在消化道和法氏囊的分布,滴鼻能提高基因疫苗在呼吸道的分布,肌肉注射能使基因疫苗更快速地分布到各组织;另外,肌肉注射和基因枪轰击法均与免疫剂量呈现一定的相关性。当前3株已经完成全基因测序的鸭瘟病毒,CHv株基因组最大,由162175碱基对构成。作为一种强毒株,对其进行基因重组研究,能够更有效地揭示基因在鸭瘟病毒中的作用。本研究首先以CHv gC基因为靶位点,克隆了该基因两侧各1.3kb左右的片段作为同源臂,将增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因插入其中,构建了被EGFP替换了gC基因前1246bp的DPV重组转移载体pUC-△gC-EGFP。为了有效控制EGFP基因的插入方向以使其表达不受gC启动子影响,本研究首先删除了pEGFP-C1上Xho Ⅰ和Xba Ⅰ(不包括二者)之间的多克隆位点,接着通过PCR的方式扩增出包含CMV立即早期启动子、EGFP基因、转录终止信号SV40polyA共1579bp的片段,再将其克隆至T载体。随后,将pUC-△gC-EGFP质粒和DPV CHv共同转染鸭胚成纤维细胞(duck embryo fibroblast, DEF),倒置荧光显微镜下结合绿色荧光进行空斑纯化,成功获得了纯化的表达EGFP基因的DPVgC缺失株DPV-△gC-EGFP.将DPV-△gC-EGFP在DEF上连续传30代以上,并进行PCR检测、测序分析及其在鸭体内、体外生物学特性研究。DPV-△gC-EGFP在DEF上连续传代表明EGFP基因能够稳定遗传并正确表达。PCR和测序结果显示DPV-△gC-EGFP中gC片段内部序列与预期一致。与DPV亲本株相比,DPV-△gC-EGFP病毒总的滴度下降了约50倍,受影响最大的是病毒释放到上清中的滴度下降了40倍；MEM液体培养基中可见DPV-△gC-EGFP主要通过细胞间传递；透射电镜下,很难发现游离的DPV-△gC-EGFP病毒颗粒；这些结果表明gC在病毒的装配中发挥作用。另外,可以观察到感染DPV-△gC-EGFP的DEF形成了多核巨细胞病毒,说明gC在鸭瘟病毒形成的细胞融合中发挥抑制作用。接种鸭的试验表明DPV-△gC-EGFP致病性降低,能诱发一定的中和抗体,并为接种鸭提供100%抗强毒攻击的保护,揭示DPV gC缺失株有望发展成为有效预防鸭瘟的基因工程疫苗。鸭瘟病毒糖蛋白E (glycoprotein E, gE)基因在不同毒株间相似性为99%,因为具有较好的免疫原性和免疫反应性,所以已经建立了基于gE的ELISA方法。鉴于在α-疱疹病毒中gE是重要的毒力基因,本研究构建了表达EGFP的鸭瘟病毒gE缺失株DPV-△gE-EGFP。PCR、测序分析及免疫荧光法结果表明DPV-△gE-EGFP中gE基因被EGFP基因替换,不再表达gE蛋白。连续传代结果说明DPV-△gE-EGFP能够稳定遗传并表达EGFP蛋白。与亲本株相比,DPV-△gE-EGFP病毒滴度降低约9倍,形成空斑能力显著降低,一步生长曲线表明病毒感染前期增殖减慢,这些结果表明gE的缺失影响了病毒在细胞间传递的能力。动物试验方面,DPV-△gE-EGFP除了引起接种鸭轻微的体温升高,未表现其它异常症状,说明gE基因是鸭瘟病毒重要的毒力基因。从中和抗体试验结果来看,虽然与gC缺失株相比显著降低,但是DPV-△gE-EGFP同样可为接种鸭提供100%抗强毒攻击的能力,并且接种强毒后,无异常临床变化,揭示DPV gE缺失株更有希望发展成为一种有效预防鸭瘟的标记疫苗。