蛋白质可逆的磷酸化与去磷酸化是调节细胞内信号转导的重要机制,影响并参与许多生理活动和细胞生命进程,包括细胞的增殖、发育与分化、肌肉收缩、新陈代谢、基因调控等。许多疾病的产生和异常的磷酸化相关,如癌症、阿尔茨海默症、慢性炎症和糖尿病等,所以能够调控蛋白质磷酸化/去磷酸化的激酶和磷酸酶是非常有潜力的药物靶点。目前,已经有许多靶向蛋白激酶的药物在临床上使用,然而靶向磷酸酶药物的开发与利用仍处于探索阶段。本课题研究旨在发现和挖掘新颖的蛋白质磷酸酶抑制剂,为磷酸酶靶向药物的研发提供依据。根据底物的特异性,蛋白磷酸酶可以分为3类:丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PSPs)、酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPs)和双特异性蛋白磷酸酶(DUSPs)。丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶又分为PPP家族和PPM家族,其中PPM家族包括锰离子镁离子依赖磷酸酶如PP2C等,目前已有PPM1A、PPM1B(Protein Phosphatase,Mg2+/Mn2+Dependent,1B)等17个成员。蛋白磷酸酶PPM]B属于丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族,具有金属离子依赖性,能够被Mg2+或Mn2+激活,在组织中分布广泛,已有研究证实PPM1B在细胞应激信号通路细胞周期进程中起重要调控作用。然而目前尚未发现有关于PPM1B特异性抑制剂的报道,寻找PPM1B的抑制剂对发掘其相互作用蛋白、生物学功能以及研发新药具有重要的科学意义。我们检测了本课题组已有的部分天然产物和基于天然产物骨架合成的化合物对PPM1B的抑制作用,共筛选了 182个化合物,结果有7个化合物对蛋白磷酸酶PPM1B有较好的抑制效果,半数抑制浓度(IC50值)小于10μM。研究结果表明化合物1(HN252)对PPM1B的抑制类型为竞争性抑制,Ki值为0.52 μM,能够特异性抑制磷酸酶PPM1B和PPM1A,对PPM1A的抑制类型为非竞争性抑制,Ki值为0.48 μM。我们深入研究了 HN252的体外抑制机制,发现HN252对PPM1B突变体R33K和K170A的IC50值远高于其对野生型的,我们推测HN252能够通过与PPM1B活性位点第33位精氨酸和第170位赖氨酸结合起抑制作用。我们通过蛋白质结晶技术,得到PPM1B蛋白的针状晶体,未能够获得HN252与PPM1B的复合物晶体。在细胞实验中,我们观察到HN252能够上调细胞内蛋白的丝/苏氨酸位点磷酸化水平,能够上调PPM1B的底物AMPKα等丝/苏氨酸位点磷酸化水平,能够进入细胞抑制内源性PPM1B的活性,进而影响其底物的磷酸化水平。随后我们采用了蛋白芯片技术,从蛋白组学的角度研究了 HN252对细胞内信号转导途径的影响,发现HN252能够影响HL7702细胞内上百种蛋白质水平,并且能够影响细胞增殖、免疫应答、代谢调控以及器官再生等100多种生物学过程。我们研究HN252细胞毒性时发现它能够促进MIN6细胞增殖,对肿瘤细胞Hela、PC3细胞无细胞毒性。最后我们研究了 HN252在小鼠体内的作用,发现HN252无严重急性中毒的危险性,对小鼠肝脏和胰岛不会造成损伤,对肝损伤和胰岛损伤无显著的保护作用。综上所述,通过筛选PPM1B抑制剂,我们发现首个能够高效、特异性抑制PPM1B和PPM1A的活性的化合物HN252,能够通过与PPM1B第33位精氨酸和第170位赖氨酸结合发挥抑制作用,能够影响细胞内蛋白磷酸化进程,促进胰岛细胞增殖,体内无毒副作用。我们的研究成果为发掘更多的PPM1B抑制剂及其更多的功能提供了新的研究思路。