【摘 要】
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近年来,草场退化现象不断加剧,严重影响了生态平衡和可持续发展,而黄花棘豆作为主要的草原毒害草之一,由于其自身极强的抗逆性和适应性而广泛蔓延。本课题前期对黄花棘豆在3种逆境胁迫(ABA,NaCl和PEG)处理下的转录组数据分析显示ABF2类转录因子可能参与黄花棘豆的抗逆反应,但其调控机理仍不清楚。因此,本研究以前期工作为基础,以黄花棘豆转录因子OoABF2为切入点,对其上游互作进行蛋白筛选与鉴定,为
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近年来,草场退化现象不断加剧,严重影响了生态平衡和可持续发展,而黄花棘豆作为主要的草原毒害草之一,由于其自身极强的抗逆性和适应性而广泛蔓延。本课题前期对黄花棘豆在3种逆境胁迫(ABA,NaCl和PEG)处理下的转录组数据分析显示ABF2类转录因子可能参与黄花棘豆的抗逆反应,但其调控机理仍不清楚。因此,本研究以前期工作为基础,以黄花棘豆转录因子OoABF2为切入点,对其上游互作进行蛋白筛选与鉴定,为探明黄花棘豆抗逆性的分子机制提供理论依据。(1)本研究以OoABF2转录因子(accession number:KU877410.1)为切入点,结合课题组已有研究工作和国内外文献报道,首先确定SnRK2s蛋白激酶家族为目标基因,随后成功克隆出黄花棘豆中的所有8个SnRK2s激酶家族:暂时命名为OoSnRK2.1-OoSnRK2.8(accession number:MH636330-MH636337)。(2)通过T4 DNA连接酶分别将OoABF2和pGADT7连接,将OoSnRK2s与pGBKT7连接,构建真核重组质粒,利用酵母双杂交技术,在酵母细胞体内筛选鉴定出了与OoABF2转录因子相互作用的SnRK2激酶蛋白为OoSnRK2.1和OoSnRK2.6。(3)构建OoSnRK2.1-pSPYNE、OoSnRK2.6-pSPYNE和OoABF2-pSPYCE重组质粒,利用双分子荧光互补技术,在烟草表皮细胞内再次体内验证了OoABF2转录因子与OoSnRK2.1和OoSnRK2.6存在相互关系,且相互作用位点都在细胞核。(4)将OoSnRK2.1和OoSnRK2.6分别与pGEX-4T-1连接,将OoABF2和pET-32a连接,通过原核诱导表达出3个可溶性的目标蛋白,通过Pull-Down技术在体外进一步确证了OoABF2转录因子与OoSnRK2.1和OoSnRK2.6为互作蛋白。(5)综合利用各种生物信息学方法对OoSnRK2.1和OoSnRK2.6基因进行生物信息学分析,解析了这两个蛋白的基本理化性质,结果表明目标蛋白都是亲水性蛋白,都没有跨膜结构域和信号肽,都是核定位蛋白,都包括特定的保守结构域,都含有磷酸化位点。通过构建系统进化树发现OoSnRK2.1蛋白与蒺藜苜蓿(XP 003615157.1)以及鹰嘴豆(XP 004490378.1)蛋白的一致性最高;OoSnRK2.6蛋白也与蒺藜苜蓿(XP013456889.1)蛋白序列同源性最高。(6)在3种不利胁迫(ABA,NaCl和PEG)处理下,运用qRT-PCR技术对目标基因OoSnRK2.1和OoSnRK2.6进行表达谱分析,结果表明:两者都能够由ABA激活,并且同时在3 h处达到较高的转录水平,在NaCl和PEG的处理下,OoSnRK2.1和OoSnRK2.6也能够被诱导表达,结果表明二者可能主要通过依赖ABA信号途径参与抗逆反应。综上所述,本研究表明黄花棘豆OoABF2转录因子和其上游的OoSnRK2.1/OoSnRK2.6激酶家族通过依赖于ABA的信号通路在逆境胁迫中发挥了重要的作用,对于揭示和阐明黄花棘豆抗逆机制具有重要的意义。
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