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犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)属于甲型流感病毒,是具有囊膜且分节段的单链负股RNA病毒。已有研究证实,H3N2是中国地区CIV流行的主要亚型。CIV可以造成犬群的呼吸道症状,且易引发二次细菌感染,出现肺炎、胸膜肺炎、慢性支气管炎等并发症。流感病毒HA片段对于病毒感染的宿主范围、复制能力及致病性等起关键作用。本研究以A/canine/Jiangsu/06/2010(H3N2)完整的8个基因片段作为骨架,探讨HA L222W和HA R326K位点突变对CIV传播和毒力的影响;同时利用犬流感病毒、伪中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius,Sp)和犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK),建立并优化了病毒-细菌体外细胞共感染模型,研究CIV的预感染对伪中间葡萄球菌继发感染的作用。1 H3N2亚型犬流感病毒HA片段定点突变株的构建为了研究H3N2亚型犬流感病毒HA蛋白222位和326位氨基酸在病毒感染中的作用,利用定点突变方法分别构建了 pBD-HA、pBD-HAL222W、pBD-HAR326K、pBD-HA L222W+R326K重组质粒。利用八质粒反向遗传操作系统,将A/canine/Jiangsu/06/2010(H3N2)江苏分离株除HA片段以外的7个基因片段的重组质粒,分别与 pBD-HA、pBD-HAL222W、pBD-HAR326K、pBD-HAL222W+R326K重组质粒共同转染MDCK和293T细胞,成功拯救出4株病毒,分别命名为r-06、r-06/L222W、r-06/R326K、r-06/L222W+R326K。4 株病毒经过连续 8 次传代及基因测序,确认了该4株病毒可以稳定遗传。2 H3N2亚型犬流感病毒HA片段定点突变株的特性分析为了研究 HAL222W、HA R326K 位点突变对于 A/canine/Jiangsu/06/2010(H3N2)流感病毒复制能力和致病性的影响,对构建的犬流感病毒r-06/HA及r-06/HA L222W、r-06/HAR326K、r-06/HAL222W+R326K突变株进行体外细胞感染试验和小鼠体内感染试验。蚀斑形成试验和MDCK细胞上生长曲线结果显示:与r-06/HA相比,3株定点突变病毒的蚀斑更大,出现蚀斑时间更短并且滴度峰值更高,且引起更多的细胞凋亡。但是MDBK细胞上的生长曲线显示:在24h时,r-06/HA的病毒滴度显著高于r-06/HA L222W和r-06/HA L222W+R326K(P<0.001)。小鼠试验结果显示:突变株与r-06/HA相比,体重下降更多、肺脏病毒载量更高。但无论是体外还是体内试验,r-06/HA L222W+R326K的结果均介于r-06/HA与r-06/HA L222W、r-06/HA R326K之间。鸡红细胞结合和释放试验证实r-06/HA L222W+R326K影响了 HA和NA的平衡。3 H3N2亚型犬流感病毒与伪中间葡萄球菌对犬肾细胞的体外共感染为了研究犬流感病毒与伪中间葡萄球菌对犬肾细胞的共感染作用,利用犬流感病毒(CIV)、伪中间葡萄球菌(Sp)和犬肾细胞(MDCK),建立并优化了病毒-细菌体外细胞共感染模型。试验分4组:病毒单独感染组(CIV)、细菌单独感染组(Sp)、感染病毒后12h再感染细菌组(CIV/Sp)及空白对照组(C)。结果显示:病毒感染后24h,CIV/Sp组的细胞毒性为39.7%,极显著高于CIV组和Sp组(P<0.001);CIV/Sp组病毒RNA载量显著低于CIV组(P<0.001)。细菌黏附和侵袭试验表明:细菌感染后4h,CIV/Sp的黏附和侵袭量极显著高于Sp组(P<0.001),侵袭量升高20倍。细菌感染后6h,CIV/Sp组IL-6、TNF-α的表达量均极显著高于其他3组(P<0.001)。综上,H3N2亚型犬流感病毒HA蛋白222位和326位氨基酸突变可增强病毒的复制能力和致病性,并且犬流感病毒的预感染增强了伪中间葡萄球菌对体外培养细胞的继发感染。