第1章弥漫大B细胞淋巴瘤微小残留病变的实验与临床研究 背景和目的：近20多年来，由于人们对非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma，NHL)生物学行为的深入认识、有效药物的不断产生、新技术的应用以及综合治疗的实施，使B细胞NHL的治疗效果有了很大的提高，约80％的患者可以达到完全缓解(completeremission，CR)，但是一半以上的患者终究要复发。目前认为复发来源于体内残留的耐药淋巴瘤细胞，即微小残留病变(minimalresidualdisease，MRD)。如果这些导致复发的肿瘤细胞能被可靠地检测出来，对指导淋巴瘤患者缓解后的治疗、早期预测复发和预后、协助诊断分期将具有重要的意义，使我们的治疗有可能达到分子水平的CR。 目前，诊断淋巴瘤微小残留病灶，应用较多和较成功的是，定性PCR的方法检测骨髓、外周血干细胞和外周血单克隆IgH基因重排，协助分期、评价治疗效果或微小残留病变。该方法不能对起始模板数准确定量。但临床上发现阳性患者并非都出现复发或远处浸润。因此，推测IgH基因重排阳性患者是否复发，可能与IgH基因重排的表达量有关。实时荧光定量PCR(real-timefluorescencequantitativepolymerasechainreaction，RT-FQ-PCR)具有敏感性高，特异性强，快速、微量、定量分析的优点，非常适合用于检测微小残留病变。在B-NHL，染色体易位产生的融合基因和免疫球蛋白重链基因重排(immunoglobulinheavy-chaingenerearrangment，IgH-R)均可作为RT-FQ-PCR检测的靶分子。在弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma，DLBCL)因BCL-2/IgH易位只占20％～30％，而BCL-6基因与IgH发生易位时的断裂点较分散，故使用IgH基因重排作为靶分子检测较为合适。但是由于VDJ重排的多样性使每一个B细胞克隆有它自己特异的DNA序列，即重排具有多样性，突变的存在，而且突变可发生在疾病发展的不同时期，使得通用的引物和探针的设计成为困难。荧光染料标记的定量PCR方法不需要合成探针，使应用RT-FQ-PCR检测DLBCL的微小残留病灶成为可能。 本研究采用简单、快速、敏感性和特异性较高的实时荧光定量PCR方法，采用荧光染料技术，结合半巢式PCR(semi-nestedPCR)方法，以IgH基因重排为标志，对DLBCL患者治疗前后骨髓微小残留病变进行定量分析，结合临床特征，探讨荧光染料标记的实时定量PCR方法检测DLBCL微小残留病变的可行性和临床意义。 方法：44例DLBCL患者的57份骨髓标本用于检测IgH基因重排，10例非B细胞淋巴瘤的骨髓做对照组，Namalwa细胞系作阳性对照，U-937细胞系作阴性对照。淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，酚—氯仿—异戊醇抽提DNA，半巢式PCR和SYBRGreen荧光染料标记的实时荧光定量PCR方法分别检测IgH基因重排CDRⅢ。2.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物片断大小，β-actin作内参照，对IgH基因重排相对定量。 结果：1.分析融解曲线可以确定IgH基因重排产物的特异性。荧光定量PCR和半巢式PCR检测IgH基因重排的阳性率分别为63.2％和71.9％。两种方法均能在骨髓形态学阳性的标本中检测到IgH基因重排，敏感性达到100％。在初治患者和复发难治患者之间，IgH基因重排的阳性率两种方法均无统计学差异。 2.荧光定量PCR检测IgH基因重排，以年龄、性别、分期、LDH值、IPI评分、肿块大小和B症状七个因素分组作比较，Ⅰ、Ⅱ期患者IgH基因重排表达量中位数为0，Ⅲ、Ⅳ期患者IgH基因重排表达量中位数为0.35，经统计学检验，两组患者之间有显著性差异(p=0.018)，其余各组之间IgH基因重排阳性率统计学无显著性差异。半巢式PCR的结果与之相似，Ⅰ、Ⅱ期患者IgH基因重排阳性率47.6％，Ⅲ、Ⅳ期患者IgH基因重排阳性率为82.6％，Ⅲ、Ⅳ期患者IgH基因重排阳性率高于Ⅰ、Ⅱ期患者(P=0.014)。 3.荧光定量PCR检测IgH基因重排，骨髓异型细胞数量与IgH基因重排表达量经相关性回归分析，统计学有显著性差异(P=0.002)，对治疗前后骨髓IgH基因重排的分析，4例骨髓形态学阳性者，随着治疗后细胞数量的减少和治疗的好转，IgH基因重排表达量也随之下降，动态观察表达量的变化可以评价疗效。 4.半巢式PCR检测IgH基因重排，7例患者治疗前IgH基因重排阳性，治疗后5例PR，2例SD，IgH基因重排仍然为阳性，提示病情未得到有效控制，可以帮助判断病情的发展趋势，但不能精确地反映疗效。 5.荧光定量PCR检测IgH基因重排，LDH值高于正常组，IgH基因重排表达量为0.39，LDH值低于正常组，IgH基因重排表达量为0.01，经非参数检验，两组患者之间有显著性差异(P=0.046)。 结论：1.荧光染料标记的定量PCR方法结合半巢式PCR可用于弥漫大B细胞淋巴瘤的骨髓微小残留病变的检测，荧光染料标记的定量PCR较半巢式PCR更好地反映骨髓微小残留病变情况。 2.检测骨髓IgH基因重排，可以协助分期，Ⅰ、Ⅱ期患者检测到IgH基因重排不能排除远处侵犯的可能。 3.动态观察IgH基因重排表达量，可以反映疾病变化过程，评价疗效。 4.未能确定检测微小残留病变在预测预后中的价值。 第2章原发性中枢神经系统淋巴瘤临床分析 背景与目的：原发性中枢神经系统恶性淋巴瘤(primarycentralnervoussystemlymphoma，PCNSL)发病率上升并且该病预后很差。本文目的是探讨免疫正常的中国人的PCNSL的临床特征，评价大剂量氨甲蝶呤(HD-MTX)治疗PCNSL的疗效。并探讨半巢式PCR检测免疫球蛋白重链基因重排在协助分型和分期诊断中的意义方法：回顾性分析经病理证实的32例(中位年龄50岁)PCNSL患者的临床资料和治疗效果。2001年11月以前采用CHOP方案为主单用或联合全脑放疗的治疗方法，2001年12月以后采用HD-MTX为主，单用或联合全脑放疗的治疗方法。半巢式PCR检测患者石蜡组织和骨髓涂片IgH基因重排。 结果：本组PCNSL患者45岁以上的占78.1％，颅内高压为主要表现占75％，单发病灶占78.1％，未检测到脑脊液细胞学阳性病例，B细胞淋巴瘤占87.5％，弥漫性大B细胞淋巴瘤59.4％。32例中位随访期17.5个月(1～84个月)，Kaplan-Meier分析总中位生存期26个月，2年生存率52％；HD-MTX联合放疗组患者完全缓解率64.7％，中位生存期在28个月以上，2年生存率66％，疗效明显优于非HD-MTX联合放疗组；Logrank检验显示乳酸脱氢酶正常、活动状态(PS)评分在0～1的患者生存期较长。Cox模型显示PS状况、LDH水平和治疗措施是PCNSL的预后因素，PS越大、LDH水平越高，生存期越短，使用HDMTX+WBRT治疗，患者生存期较长。 7例PCNSL中，5例检测到IgH基因重排(71.4％)。10例骨髓涂片标本，2例见IgH基因重排条带。 结论：PCNSL多发于中老年人，颅内高压为主要表现，B细胞亚型占绝对优势。大剂量MTX联合全脑放疗治疗PCNSL有效和可行。PS状况、LDH水平和是否接受HDMTX+WBRT是PCNSL的预后因子。PCNSL患者有可能伴有骨髓侵犯。