脑梗死又称缺血性脑卒中，世界卫生组织将“缺血性卒中”定义为一种临床综合征，其特征是由于脑血管发生血流较少或缺血，局灶性脑组织缺血、缺氧持续一定时间会导致局部神经元死亡和继发性脑损伤。大脑血管血流中断后会导致局部脑组织的氧气和葡萄糖摄入减少，从而增加患者的残疾率和病死率。众所周知，缺血性卒中具有高发病率、高复发率、高死亡率以及高致残率，给社会和家庭都带来的沉重的负担。缺血性卒中的危险因素包括年龄、吸烟、糖尿病、高血压以及肥胖等，如心脏瓣膜病以及心房颤动这些容易导致栓塞的疾病同样会增加患病的危险。随着生活方式的改变，人口的老龄化，包括缺血性卒中的脑血管疾病的发病率有逐年增高的趋势，且已成为我国居民死亡最主要的原因，所以对缺血性卒中的防治刻不容缓。尽管最近的研究取得了一些进展，但在全球范围内缺血性卒中仍然是一个棘手的问题。　　目前的一些研究表明，中枢神经系统的自我修复能力是非常有限的。但是缺血性卒中发病后，机体的自我修复能力主要通过神经再生，神经可塑性以及血管再生从而达到神经修复的最终目的。越来越多的研究证明，血管再生对于神经修复所产生的作用较为重要。但是非常遗憾的是，目前并没有特别有效的方法能够清楚的观察到这些新生的血管的具体变化以及走向。　　目前已经有多种方法通过标记组织切片中梗塞周围组织的结构变化从而来量化血管密度。随着共聚焦多标记技术的发展，有许多检测和量化动物模型和人的血管变化的方法已被广泛应用。这其中就包括血管相关抗原的免疫组织化学方法（包括血小板内皮细胞粘附分子（PECAM-1），其也被称为分化簇31（CD31））、von Willebrand因子对内皮细胞的作用、基底层中的胶原蛋白 IV、层粘连蛋白以及纤连蛋白等。同样在内皮细胞上存在一些蛋白质抗原，它们可以利用葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）和整联蛋白αvβ3来区分微血管的再生。然而，所有这些方法在显微镜下仅显示血管壁的染色情况。由于无法观察到血管腔内的染色情况，所以这些对血管密度进行量化的方法都是不准确的。此外，多聚甲醛固定的脑组织中的大多数血管对这些抗原的染色性很差。在活体转基因动物中，大脑的毛细血管网络可被荧光蛋白标记，使其可用于长期观察微血管在特定位置的结构以及血液动力学变化。然而，长期研究活体血管结构变化通常依赖于双光子激光扫描显微镜和基因工程的新技术，由于昂贵的成本使其不适用于大多数实验室。　　明胶-墨汁灌注是检测微血管的一种方法。明胶可以在高于40℃的温度下溶于水中，然后在低于30℃的温度下凝结。明胶-墨汁灌注使外周视网膜血管腔完全充盈，血管连续性令人满意。之前有研究通过使用明胶-墨汁的方法来观察大鼠视网膜微血管，由明胶-墨汁标记的视网膜微血管数量多于vWf免疫染色。此外，明胶-墨汁灌注不会对同一组织中神经元或神经胶质细胞的免疫染色造成污染。除了墨汁灌注之外，明胶还可以与不同的荧光物质共存从而与脑中的其他抗原进行共染色。　　本研究采用健康成年雄性 C57BL/6 小鼠为研究对象，建立电凝法远端大脑中动脉闭塞（distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO）模型。在此研究中，我们通过明胶-墨汁灌注的方法来测试标记是否是量化半胱氨酸和梗塞中心血管生成的替代方法。我们还观察了这种标记技术是否可以用来检测在发生缺血性卒中后同一脑片中形成软脑膜吻合。并通过使用Image J分析软件，从而提供了详细的血管生成的量化结果。本研究分为三部分，各部分内容概述如下。　　第一部分 通过行为学以及血流动力学的方法对实验性脑梗死小鼠进行观察　　目的：通过使用行为学以及血流动力学的方法来观察实验性脑梗死小鼠的神经功能缺损以及脑梗死体积从而从直观方面来验证 dMCAO 模型的有效性，并为接下来明胶-墨汁染色的测定提供有效的证据。　　方法：采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象，体重20-25 g，8-12周龄，通过电凝法建立dMCAO模型。实验一：将C57BL/6小鼠随机分为以下各组：假手术组（Sham）：动物接受假手术但并不闭塞大脑中动脉；术后3天组（3 d）：动物接受dMCAO后3天；术后7天组（7 d）：动物接受dMCAO后7天；术后14天组（14 d）：动物接受dMCAO后14天。对采用健康成年雄性C57BL/6小鼠建立dMCAO模型，并对术前以及术后3天、7天、14天的小鼠进行Rota-Rod以及mNSS神经功能评分。实验二：将C57BL/6小鼠随机分为以下各组：假手术组（Sham）：动物接受假手术但并不闭塞大脑中动脉；Vehicle组（Vehicle）：动物接受dMCAO；术后3天组（3 d）：动物接受dMCAO后3天；术后7天组（7 d）：动物接受dMCAO后7天；术后14天组（14 d）：动物接受dMCAO后14天。每一组使用TTC（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride）染色法来测定脑梗死体积。实验三：将C57BL/6小鼠随机分为以下各组：假手术组（Sham）：动物接受假手术但并不闭塞大脑中动脉；Vehicle组（Vehicle）：动物接受dMCAO；术后3天组（3 d）：动物接受dMCAO后3天；术后7天组（7 d）：动物接受dMCAO后7天；术后14天组（14 d）：动物接受dMCAO后14天。每一组使用激光散斑成像仪监测脑血流量（cerebral blood flow，CBF）。　　结果：　　1. Rota-Rod实验结果：与没有进行大脑中动脉闭塞的Sham组相比，进行大脑中动脉闭塞后3 d组、7 d组和14 d组的神经功能出现了明显的下降（P＜0.05）。而14 d组与3 d组相比，神经功能有了明显的好转（P＜0.05）。mNSS结果显示：与没有进行大脑中动脉闭塞的Sham组相比，进行大脑中动脉闭塞后3 d组、7 d组和14 d组的神经缺陷评分出现了明显的上升（P＜0.05）。而14d组与3d组相比，神经缺陷评分则有了显著改善（P＜0.05）。　　2. TTC染色结果显示：与没有进行大脑中动脉闭塞的Sham组相比，进行大脑中动脉闭塞后即刻、3 d组、7 d组以及14 d组的小鼠的脑梗塞体积显著增加（P＜0.05）。　　3. 激光散斑成像CBF测量结果显示：与没有进行大脑中动脉闭塞的Sham组相比，进行大脑中动脉闭塞后即刻、3 d组、7 d组以及14 d组的小鼠的脑血流量明显减少（P＜0.05）。　　第二部分 通过灌注不同浓度的明胶-墨汁来确定最佳浓度，并对健康小鼠大脑半球不同区域的微血管进行观察　　目的：通过对健康小鼠灌注不同浓度的明胶-墨汁来检测在何种浓度下灌注的微血管最为清晰，并且观察哪个部位的微血管最适合接下来的观察。　　方法：采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象，体重20-25 g，8-12 周龄。实验一：将C57BL/6小鼠随机分为两组：20%组：给小鼠灌注20%的明胶-墨汁；3%组：给小鼠灌注3%的明胶-墨汁。取材后对两组大脑的微血管进行比较从而观察应用何种浓度的明胶-墨汁进行灌注可以呈现出更清晰的微血管。实验二：应用3%的明胶-墨汁对小鼠进行灌注，观察各个区域的微血管的密度以及填充情况。　　结果：　　1. 对小鼠进行20%明胶-墨汁灌注后，我们观察到在Willis环、基底动脉以及大脑前后动脉上表现出令人满意的充盈以及皮层动脉血管的连续性。由软脑膜血管提供的潜在的二级侧支途径也在低背景下实现了良好的填充。然而，由于 20%明胶-墨汁的高粘度，与使用 3%明胶-墨汁灌注相比，在微毛细血管中观察到较少的填充效果。　　2. 对小鼠进行3%明胶-墨汁灌注后，我们对大脑前动脉（ACA）、大脑中动脉（MCA）、大脑后动脉（PCA）、纹状体以及海马附近的微血管进行观察到在MCA附近的区域，这些穿支血管和毛细血管的数量最多，充盈性也表现的最好。与MCA相比，剩下四个区域的血管密度明显减少（P＜0.05）。海马区附近的微血管与纹状体区域以及大脑前动脉区域附近的血管密度相比也有明显的减少（P＜0.05）。　　第三部分 通过不同的方法对不同时间段的实验性脑梗死小鼠的血管再生进行观察　　目的：通过明胶-墨汁灌注以及与HE染色共染的方法对不同时间段、不同区域的实验性脑梗死小鼠的血管再生进行观察。　　方法：采用健康成年雄性 C57BL/6 小鼠为研究对象。实验一：应用3%的明胶-墨汁灌注脑梗死后3天的小鼠，取材后在显微镜下观察梗死灶、梗死灶对侧、梗死灶上，梗死灶上对侧、梗死灶下、梗死灶下对侧、基底节区以及基底节区对侧的血管密度，并对其进行统计学分析。实验二：应用3%的明胶-墨汁灌注脑梗死后7天小鼠，取材后在显微镜下观察梗死灶、梗死灶对侧、梗死灶上，梗死灶上对侧、梗死灶下、梗死灶下对侧、基底节区以及基底节区对侧的血管密度，并对其进行统计学分析。实验三：应用3%的明胶-墨汁灌注脑梗死后14天小鼠，取材后在显微镜下观察梗死灶、梗死灶对侧、梗死灶上，梗死灶上对侧、梗死灶下、梗死灶下对侧、基底节区以及基底节区对侧的血管密度，并对其进行统计学分析。实验四：将C57BL/6小鼠随机分为两组：假手术组（Sham）：动物接受假手术但并不闭塞大脑中动脉，并用 HE 染色和明胶-墨汁灌注双重标记来观察细胞和毛细血管的轮廓；术后14天组（14 d）：动物接受dMCAO后14天，并用HE染色和明胶-墨汁灌注双重标记来观察细胞和毛细血管的轮廓。　　结果：　　1. 实验一的结果显示：通过 3%的明胶-墨汁灌注我们观察到梗死灶中心以及缺血半暗带的毛细血管的数量明显减少，而梗死灶中心几乎见不到完整的充盈的毛细血管。与此相比，梗死灶对侧的毛细血管则表现为充盈良好且并无明显减少。根据对不同区域的毛细血管密度进行统计学分析可见，梗死灶内的血管密度与梗死灶对侧、梗死灶上、梗死灶下、基底节区相比有了显著的下降（P ＜0.05）。而梗死灶上与梗死灶上对侧、梗死灶下与梗死灶下对侧、基底节区与基底节区对侧的血管密度相比也有明显下降（P＜0.05）。　　2. 实验二的结果显示：通过使用 3%的明胶-墨汁灌注对不同区域的毛细血管密度进行统计学分析可见，梗死灶内的血管密度与梗死灶对侧、梗死灶上、梗死灶下、基底节区相比有了显著的下降（P＜0.05）。而梗死灶上与梗死灶上对侧也有明显下降（P＜0.05）。而梗死灶下与梗死灶下对侧、基底节区与基底节区对侧的血管密度相比则无明显差异（P＞0.05）。　　3. 实验三的结果显示：通过 3%的明胶-墨汁灌注我们观察到在术后第14天，梗死灶中心与缺血半暗带中的血管密度明显增加。新生的穿支血管和毛细血管在梗死灶中心中异常增长，其表现为异常的曲折与充盈。根据对不同区域的毛细血管密度进行统计学分析可见，梗死灶内的血管密度与梗死灶对侧、梗死灶上、梗死灶下、基底节区相比有了显著的增加（P＜0.05）。而梗死灶上与梗死灶上对侧、梗死灶下与梗死灶下对侧、基底节区与基底节区对侧的血管密度相比则无明显差异（P＞0.05）。　　4. 实验四的结果显示：我们发现，缺血性卒中的恢复期，梗死灶中心内HE标记的细胞核数目明显增多，同时源于软脑膜吻合的新生血管也明显增多。与此同时，梗死灶中心的坏死斑块出现退化，其表现为嗜酸性染色，同时核成分也渐渐消失。总之，我们在这些使用明胶-墨汁灌注切片中观察到，在缺血性卒中恢复期梗死灶中心区域发生了三个主要变化，即：胶质细胞增殖加快；继发性软脑膜侧支血管生成增强；胶质细胞变性坏死并形成斑块。　　结论：　　1. 本实验通过电凝法成功建立实验性小鼠右侧 dMCAO 模型，发现缺血性卒中急性期的实验性小鼠神经功能出现了严重的缺损，脑血流量出现了明显的减少。而处于恢复期的实验性小鼠的神经功能出现了明显的好转，脑梗死体积也出现了明显的下降，而脑血流量也出现了明显的回升。　　2. 本实验通过使用不同浓度的明胶-墨汁对实验性小鼠进行灌注，并且首次使用3%的明胶-墨汁进行灌注，从而解决了一直以来无法清楚的观察到缺血性卒中后微毛细血管到底是如何再生的这个关键问题，也为今后微血管的灌注与观察提供了一个新的方法。　　3. 本实验通过应用3%的明胶-墨汁对脑梗死后3、7、14天的小鼠进行灌注发现，在缺血性卒中急性期，梗死灶中心区域的穿支血管和微毛细血管出现碎裂和硬化。在缺血性卒中恢复期，脑皮质支呈现出大量曲折、肿胀的软脑膜血管增生，它们可以跨越梗死灶中心的皮质表面。与此同时，通过应用3%的明胶-墨汁和HE染色进行共染，从而发现在缺血性卒中恢复期会发生胶质细胞增殖加快；继发性软脑膜侧支血管生成增强；胶质细胞变性坏死并形成斑块的现象。