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目的:本课题拟制备脓毒症大鼠模型,采用实验方法验证假说:半夏泻心汤可以通过诱导HO-1表达,减轻炎症反应,从而降低脓毒症大鼠肠道机械屏障的损伤;与此同时,采用siRNA干扰技术对实验结果加以反证。
方法:采取盲肠结扎穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)法造模。
1.将200只造模后符合纳入标准的清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠采用随机数字表法均分为:假手术对照组、脓毒症组、半夏泻心汤组、腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组、腺病毒空载组,每组留10只用于观察大鼠自然存活时间。
2.分别于造模后6h、12h、24h时间节点处死各组大鼠:
(1)观察大鼠肠道(大肠+小肠)组织形态学变化,同时检测血清中D-乳酸、二胺氧化酶、内毒素水平;
(2)检测血清中HO-1、IL-10、IL-6、TNF-α、NF-κ Bp65的含量变化;
(3)测定肠道组织中HO-1、IL-10、IL-6、TNF-α、NF-κ Bp65蛋白表达水平情况;
(4)测定肠道组织中HO-1、IL-10、IL-6、TNF-α、NF-κ Bp65基因表达水平情况;
(5)于造模后72h内观察大鼠的存活情况,比较各组大鼠的死亡率。
结果:1.在造模后不同时间节点(6h-12h-24h)观察:
(1)依照肠道组织粘膜结构受损程度由重到轻排序,分别为:脓毒症组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>假手术对照组;
(2)测定血清中D-乳酸、二胺氧化酶、内毒素水平,由高到低分别为:脓毒症组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>假手术对照组。
2.在造模后不同时间节点(6h-12h-24h)检测:
(1)血清中HO-1水平由高到低分别为:半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>脓毒症组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>假手术对照组;
(2)血清中IL-10水平由高到低分别为:半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>脓毒症组>假手术对照组;
(3)血清中IL-6、TNF-α、NF-κBp65水平由高到低分别为:脓毒症组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>假手术对照组。
3.在造模后不同时间节点(6h-12h-24h)测定:
(1)肠道组织HO-1蛋白/基因表达水平由高到低分别为:半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>脓毒症组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>假手术对照组;
(2)肠道组织IL-10蛋白/基因表达水平由高到低分别为:半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>脓毒症组>假手术对照组;
(3)肠道组织IL-6、TNF-α、NF-κBp65蛋白/基因表达水平由高到低分别为:脓毒症组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>假手术对照组。
4.各组大鼠造模后72h内的死亡率(%):假手术对照组VS脓毒症组VS半夏泻心汤组VS腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组VS腺病毒空载组=30% VS90% VS40% VS80% VS50%(各组n=10)。
结论:半夏泻心汤可以诱导HO-1提高表达水平,改善脓毒症大鼠肠道机械屏障功能,降低其死亡率,机制可能与高表达的HO-1调控炎症反应,使促炎反应和抑炎反应趋于平衡,从而减轻了炎症反应有关。本研究结果为中医传统名方在改善脓毒症预后方面的应用提供了依据。
方法:采取盲肠结扎穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)法造模。
1.将200只造模后符合纳入标准的清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠采用随机数字表法均分为:假手术对照组、脓毒症组、半夏泻心汤组、腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组、腺病毒空载组,每组留10只用于观察大鼠自然存活时间。
2.分别于造模后6h、12h、24h时间节点处死各组大鼠:
(1)观察大鼠肠道(大肠+小肠)组织形态学变化,同时检测血清中D-乳酸、二胺氧化酶、内毒素水平;
(2)检测血清中HO-1、IL-10、IL-6、TNF-α、NF-κ Bp65的含量变化;
(3)测定肠道组织中HO-1、IL-10、IL-6、TNF-α、NF-κ Bp65蛋白表达水平情况;
(4)测定肠道组织中HO-1、IL-10、IL-6、TNF-α、NF-κ Bp65基因表达水平情况;
(5)于造模后72h内观察大鼠的存活情况,比较各组大鼠的死亡率。
结果:1.在造模后不同时间节点(6h-12h-24h)观察:
(1)依照肠道组织粘膜结构受损程度由重到轻排序,分别为:脓毒症组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>假手术对照组;
(2)测定血清中D-乳酸、二胺氧化酶、内毒素水平,由高到低分别为:脓毒症组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>假手术对照组。
2.在造模后不同时间节点(6h-12h-24h)检测:
(1)血清中HO-1水平由高到低分别为:半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>脓毒症组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>假手术对照组;
(2)血清中IL-10水平由高到低分别为:半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>脓毒症组>假手术对照组;
(3)血清中IL-6、TNF-α、NF-κBp65水平由高到低分别为:脓毒症组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>假手术对照组。
3.在造模后不同时间节点(6h-12h-24h)测定:
(1)肠道组织HO-1蛋白/基因表达水平由高到低分别为:半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>脓毒症组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>假手术对照组;
(2)肠道组织IL-10蛋白/基因表达水平由高到低分别为:半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>脓毒症组>假手术对照组;
(3)肠道组织IL-6、TNF-α、NF-κBp65蛋白/基因表达水平由高到低分别为:脓毒症组>腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组>半夏泻心汤组≈腺病毒空载组>假手术对照组。
4.各组大鼠造模后72h内的死亡率(%):假手术对照组VS脓毒症组VS半夏泻心汤组VS腺病毒(SiRNA干扰HO-1)组VS腺病毒空载组=30% VS90% VS40% VS80% VS50%(各组n=10)。
结论:半夏泻心汤可以诱导HO-1提高表达水平,改善脓毒症大鼠肠道机械屏障功能,降低其死亡率,机制可能与高表达的HO-1调控炎症反应,使促炎反应和抑炎反应趋于平衡,从而减轻了炎症反应有关。本研究结果为中医传统名方在改善脓毒症预后方面的应用提供了依据。