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视网膜发育是近年来眼科学及神经科学研究的热点之一,其发育过程是一个多因素参与的过程,是按照高度特异的时空表达模式和相互作用的结果,对其研究所获得知识,有助于我们了解视网膜正常生理功能和病理变化。目前有关视网膜的结构,发育和病理的研究比较多。但是有关视网膜胶质细胞发育和双极细胞发育及其关系仍需更详细的研究。因此,我们利用HE染色法和免疫荧光标记法等技术,试图对以下方面进行进一步的探讨:①视网膜的发生与片层化过程;②视网膜中胶质细胞的增殖规律及与视网膜片层化的关系;③双极细胞的分化过程及与视网膜角质细胞的关系。旨在通过上述研究,进一步认识视网膜的发生、发育特点和生理特征,有助于了解视觉的发育、先天性视网膜疾病的发病机制,也为视网膜神经细胞损伤后的的再生修复奠定基础,为临床治疗视网膜疾病提供一定的理论指导。 目的通过观察不同年龄的小鼠视网膜形态来研究视网膜片层化过程;观察视网膜胶质细胞增殖和分化过程;研究小鼠视网膜胶质细胞增殖与双极细胞分化过程的关系; 方法应用免疫荧光和HE染色法对各个年龄点的(胚胎及出生后)小鼠视网膜形态结构及胶质细胞的增殖、分化进行观察,并对视网膜Müller细胞和PKC-α阳性细胞密度进行统计。各个年龄小鼠共计123只。 结果(1)小鼠视网膜片层化E12.5时小鼠出现胚眼,在E17时整个视网膜仅分化出色素上皮层,其余部分大致可分为内、外两部分。近内侧部分细胞排列疏松,染色较浅,胞体较大且圆,此后逐渐发育为节细胞层和内网层;近外侧细胞层为神经母细胞层,细胞排列紧密,染色较深,由外而内密度降低。节细胞层与神经母细胞层之间出现纤维过渡层,最后形成内网层。在P3时节细胞层细胞为3-4层细胞排列,内网层进一步变宽,约P10时这条纤维带使神经母细胞层分为近内侧的内核层和近外侧的外核层,此时节细胞层细胞分化为单层细胞排列。P14时外网层进一步变宽,视网膜基本分化完全,十层结构清晰可见。P14以后至成年小鼠,视网膜形态结构无明显变化,但片层化结构日趋成熟。 (2)小鼠视网膜星形胶质细胞的发育过程星形胶质细胞有着离心型的发育模式。P0时GFAP阳性细胞仅出现在视乳头和邻近周围区域,细胞呈细长流线型,多数只有两个突起,还没有出现典型的星状外形。P5时GFAP阳性细胞以视乳头为中心向周边放射性生长,细胞突起增多并变粗变宽,突起之间形成网状或环状联系,细胞形态接近星状。P7时星形胶质细胞出现在整个视网膜的节细胞层中。P10时GFAP阳性细胞突起相互缠绕形成的网状联系中出现中空“管样”结构,细胞形态变成典型的星状外形,即出现有5-7个突起,其突起呈细线型并相互缠绕形成很多中空的“管腔”样结构,类似血管网的脉络。 (3)小鼠视网膜Müller细胞发育及其与双极细胞的关系 P0-P4时小鼠视网膜几乎不表达GS,P6-P10时开始在小鼠视网膜Müller细胞零星中表达GS,P12-P14时视网膜神经纤维层、神经节细胞层和内网层及内核层开始表达GS,P14-P30视网膜从内界膜到外界膜均表达GS,主要定位在Müller细胞的内侧突起、外侧突、终足和外界膜处的微绒毛中,分布及染色强度无明显改变;胞体主要分布在内核层,呈椭圆形或者多角形,胞体向内外两侧发出突起,占据从内界膜到外界膜整个视网膜厚度。统计学分析,发现GS阳性细胞数量从P6开始到P14逐渐升高,P14到P30期间数量有小幅度减少,但是P30到P90细胞数量基本不变。在P6时可标记到少量PKC-α阳性细胞,零乱地排列在外网层。到P10时,阳性细胞染色比较明显,胞体在内核层呈2-3层排布。P12时可清晰看到大量PKC-α阳性细胞胞体在内网层和外核层连接处紧密有序得单层排布,基本形成了典型的双极细胞形态:轴突向内网层突出,树突向外网层突出。在P14时,PKC-α阳性细胞伸向节细胞层的轴突更加密集,树突和胞体的数量也增多,此时,双极细胞的发育过程基本结束,此后,细胞形态结构几乎没有变化。统计分析发现PKC-α阳性细胞表达从P6开始到P14逐渐升高,P14到P30期间数量不断减少,但是幅度不大,P30后数量和形态基本不变。同时,小鼠视网膜GS和PKC-α双标记,发现Müller细胞内、外突上发出许多细小的侧突与双极细胞的胞体相接触,提示Müller细胞在双极细胞的分化、迁移过程中伴着很重要的角色。 结论①小鼠视网膜是以神经母细胞层为基础逐渐发育为片层结构,视网膜的片层化与其功能的成熟相一致;②实验结果进一步证实了小鼠视网膜Müller细胞表达GS,但在Müller细胞分化接近结束时才表达。同时,表明Müller细胞在维持视网膜内谷氨酸的平衡,保持正常的视网膜的功能方面具有非常关键的作用。