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第一部分黄芪甲苷干预IL-1β诱导后的SW1353细胞凋亡的最佳作用浓度和培养时间目的:观察不同浓度的中药单体黄芪甲苷(Astragaloside IV,AS-IV)对IL-1β诱导后的人软骨肉瘤细胞(SW1353细胞)凋亡的影响,筛选安全作用浓度和最佳培养时间。方法:设对照组和IL-1β组,再设定5个药物浓度(25、50、100、200、500μmol·L-1)的AS-IV组。预先加入相应剂量AS-IV培养1h,再加入IL-1β(10 ng·ml-1)分别培养12h、24h和48h,重复3次。以流式细胞术检测不同浓度AS-IV对IL-1β诱导后的SW1353细胞凋亡水平。结果:1.流式细胞仪检测结果显示,SW1353细胞在IL-1β诱导后的凋亡率较对照组明显增加(P<0.05),说明造模成功。2.3个时间节点中24h各组AS-IV对细胞凋亡的影响最小,与12h和48h比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.在24h时间节点上,25、50、100和200μmol·L-1AS-IV对SW1353细胞凋亡影响与500μmol·L-1组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。100μmol·L-1AS-IV组的细胞凋亡率最小(P<0.05)。结论:1.IL-1β能诱导SW1353细胞产生明显凋亡。2.加入IL-1β后培养24h时,AS-IV对细胞凋亡的影响优于12h和48h。3.加入IL-1β后培养24h时,25、50、100和200μmol·L-1的AS-IV均能拮抗IL-1β诱导后的SW1353细胞凋亡,以100μmol·L-1浓度的拮抗作用最明显。第二部分AS-IV干预IL-1β诱导的SW1353细胞的定量蛋白质组学研究目的:对AS-IV干预IL-1β诱导后的SW1353细胞进行液相色谱-质谱分析,探讨AS-IV对SW1353细胞凋亡和软骨降解的保护作用及可能涉及的机制。方法:设立对照组、IL-1β(10 ng·ml-1)组、100μmol·L-1AS-IV组,再设立IL-1β(10 ng·ml-1)+100μmol·L-1AS-IV组,培养24h,以液相色谱-质谱分析(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS/MS)进行定量蛋白质组学研究。结果:1.差异蛋白结果显示:在IL-1β,AS-IV,AS-IV+IL-1β三组不同实验处理的条件下总共筛选到296个差异蛋白质。IL-1β组中有126个蛋白质的表达发生了改变,118个显著降低,8个表达增加;AS-IV组筛选到72个差异蛋白质,上调32个,下调40个;IL-1β和AS-IV同时干预细胞后有165个差异蛋白质,149个上调,16个下调。2.代谢通路富集分析结果提示phosphoprotein(磷酸化蛋白)和acetylation(乙酰化作用)蛋白质的数量最多。3.296个差异蛋白质中只有26个具有信号肽,比例仅占8.78%。4.有较多数量的差异蛋白质参与生物学过程中的代谢过程和细胞过程;参与分子功能中的结合和催化;参与细胞定位中的细胞器和细胞部分等。5.有83个差异蛋白质定位到48条代谢通路。29个参与嘌呤代谢,5个参与嘧啶代谢,7个参与抗生素的生物合成途径,其中TPI1、HEL-S-133P、SEPN1和AKR1B10还参与糖酵解途径,5个参与磷酸肌醇代谢途径,2个参与核糖体组分。6.AS-IV干预IL-1β诱导的软骨细胞后,Hippo信号通路的Yes相关蛋白YAP1和γ-肌动蛋白ACTG1上调。7.AS-IV干预IL-1β诱导的软骨细胞后,ECM-receptor interaction信号通路中的玻连蛋白VTN和胶原蛋白COL1A1上调。结论:1.AS-IV对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的保护作用可能通过细胞内的反应产生药物效应,并可能通过蛋白磷酸化和乙酰化起作用。较多数量的差异蛋白质通过参与生物学过程、分子功能和细胞定位起作用。2.AS-IV拮抗炎性因子IL-1β诱导的细胞凋亡作用可能是通过激活Hippo信号通路中YAP1下游靶基因而实现的;并通过上调ACTG1而保护软骨细胞骨架、维持软骨细胞形态而实现其对OA的保护作用。3.AS-IV通过上调ECM-receptor interaction信号通路中的VTN分泌而发挥拮抗软骨细胞凋亡、降低ECM降解的作用;同时胶原蛋白COL1A1上调,可能与AS-IV促使细胞分泌collagen有关,也证实了AS-IV对软骨细胞外基质的修复作用。4.AS-IV对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的保护作用是通过多条代谢通路、多靶点实现的。