论文部分内容阅读
葫芦素B（Cucurbitin B,CuB）是从自然界中广泛存在的葫芦科植物中提取、分离得到的一种四环三萜类化合物,具有保护肝脏、抗炎和抗肿瘤等生物活性,临床上用来治疗慢性肝炎及原发性肝癌。相关文献表明,CuB难溶于水,口服生物利用度低,限制了其在临床上的应用。为提高其生物利用度,本课题组前期以泊洛沙姆407为载体制备了CuB固体分散体,实验结果表明,泊洛沙姆407固体分散体可显著改善CuB的溶出度及生物利用度。但同时研究发现,以泊洛沙姆407为载体的固体分散体随着存放时间的延长,有明显结晶析出的不稳定现象。为了制备得到稳定性更好的固体分散体,本研究通过载体对CuB的抑晶试验及增加溶解度试验,初步筛选几种合适的载体材料,采用溶剂法,分别用无定形载体和半结晶载体制备CuB固体分散体,并进行物相表征、溶出度、稳定性考察,比较不同载体制备的CuB固体分散体的稳定性等性质的差异,筛选得到稳定性更好的固体分散体。再通过影响因素试验和药代动力学实验,探讨与泊洛沙姆407为载体的固体分散体稳定性和主要药代动力学参数的差异,对实验的结果进行验证。目的:建立CuB体内外含量测定及溶出度测定方法,通过抑晶试验及增加溶解度试验筛选出CuB的几种适宜载体,制备不同载体的固体分散体并对其进行质量评价。考察固体分散体的稳定性,得到稳定性更好的固体分散体,对筛选得到的CuB固体分散体进行影响因素试验和药代动力学实验,对相关研究进行验证。方法:1.应用高效液相色谱法测定CuB固体分散体的含量及其体外溶出度。2.通过增加溶解度试验和抑晶试验筛选出几种适宜载体,采用溶剂法制备不同载体的CuB固体分散体,通过差示扫描量热（DSC）、粉末X射线衍射（PXRD）、扫描电镜（SEM）、傅里叶红外光谱（FTIR）以及体外溶出度对其进行质量评价。3.通过稳定性试验和影响因素试验对固体分散体的稳定性进行研究。4.应用液-质联用技术,以大鼠为实验对象,通过灌胃给药的方式研究CuB原料药、泊洛沙姆407固体分散体和筛选得到的固体分散体在大鼠体内的药动学特征。计算相对生物利用度,比较两种CuB固体分散体与原料药之间药动学参数的差异。结果:1.采用HPLC测定固体分散体中CuB的含量。CuB在2.33～81.20μg/m L浓度范围内线性关系良好,线性方程为Y=12.856X+19.341,R2=0.9984。精密度试验表明,低、中、高三种浓度的RSD小于2%,仪器精密度良好。回收率试验表明,回收率在100.48%～103.23%之间,RSD值均小于2%,表明回收率符合要求。稳定性试验表明CuB溶液在24 h内保持稳定。采用HPLC测定溶出介质中CuB的浓度。标准曲线为Y=11.038X-0.26,R2=0.998。CuB在0.735～11.69μg/m L浓度范围内线性良好。精密度RSD均小于2%,表明仪器精密度良好,溶出液在24 h内稳定,回收率范围为102.60%～104.24%,RSD值均小于2%,回收率符合要求。2.CuB在不同载体中的溶解度试验表明,CuB在TPGS、RH 40、PLX-407、F68等表面活性剂载体中溶解度较高,在PVP K30、PVP VA 64、PVP K90、PEG-6000等载体中溶解度稍低。抑晶试验结果表明,PVP VA64对CuB的抑晶能力最好,其次是TPGS和RH 40,PVP K30和PLX-407也可以有效抑制药物核的形成。结合溶解度和抑晶试验结果,PVP VA64、PVP K30、TPGS、RH40、PLX-407均可以作为固体分散体的载体,但考虑RH40的理化性质,其不适合作为载体制备固体分散体,因此筛选PVP VA64、PVP K30、TPGS、PLX-407作为固体分散体的载体,制备单一载体的固体分散体。同时为更好提高固体分散体的稳定性,采取TPGS作为表面活性剂添加到PVP VA64和PVP K30载体中,制备复合载体固体分散体。对制备的不同固体分散体进行物相表征,DSC结果显示几种固体分散体中均未观察到CuB的吸热峰,推测药物的形态发生变化,可能以无定形状态存在于载体中。PXRD结果显示,PVP VA64、PVP K30、TPGS本身无定形,PLX-407具有部分晶型结构。以无定形载体材料制备的固体分散体中药物以无定形状态分散在载体材料中,以半结晶载体制备的固体分散体中药物以部分结晶、部分无定形形式存在。SEM显示CuB为不规则大小的条状结晶。以PVP VA64、PVP K30、TPGS无定形载体制备的固体分散体为表面光滑、大小不一的块状或鼓状结构,以半结晶载体PLX-407制备的固体分散体为表面粗糙的块状及柱状结构。FTIR结果显示固体分散体中CuB的-C=O以及-OH伸缩振动峰的峰位发生位移,证明原料药与载体之间产生氢键相互作用。体外溶出度结果表明,不同载体制备的固体分散体均提高了CuB的溶出速率及溶出度。3.稳定性试验结果证明,在25℃、95%RH条件下,以半结晶和无定形载体制备的固体分散体的含水量、溶出度、结晶度及相互作用都发生变化。在实验条件下,复合载体固体分散体相较于单一载体固体分散体吸湿性强,放置一段时间后含水量增大,实验过程中发生较明显的析晶现象,溶出度下降明显,显著影响其稳定性。半结晶固体分散体吸湿性高,结晶度大,溶出度下降。综合分析,无定形载体PVP VA64相较于PVP K30和其他载体,吸湿性更小,虽有一定的晶体析出现象,溶出度下降,但均较其他载体变化小。初步判断,无定形载体PVP VA64以及半结晶载体PLX-407相对稳定,其中PVP VA64稳定性更好。4.在保证稳定性的前提下,为制备溶出度和生物利用度更高的固体分散体,以PVP VA64为载体,通过药载比筛选出最优载药比例,制备PVP VA64固体分散体（CuB-PVP VA64-SD）。进行了高温、高湿、强光等条件下的影响因素试验,并与相同药载比的PLX-407固体分散体（CuB-PLX-407-SD）比较。强光试验表明固体分散体的外观、含量以及溶出度均无明显变化。高湿试验表明CuB-PVP VA64-SD的外观偶有结块,其含量变化不明显,溶出度偶有下降;CuB-PLX-407-SD的外观出现结块、黏连现象,样品含量及溶出变化明显,溶出度显著下降。高温试验表明CuB-PVP VA64-SD外观、含量以及溶出度均无明显变化;CuB-PLX-407-SD含量及溶出显著降低。CuB-PVP VA64-SD受高温、光照、高湿影响小,比CuB-PLX-407-SD更稳定,但也提示CuB固体分散体应在室温、干燥、密封且尽可能避光状态下保存。5.采用UPLC-MS/MS测定大鼠血浆中CuB的含量,以夹竹桃苷为内标,在0.1～10 ng/m L范围内,CuB与夹竹桃苷峰面积的比值与浓度具有良好的线性关系。QC样品的日内精密度RSD小于3.71%,日间精密度RSD小于6.16%,准确度小于7%;QC样品和夹竹桃苷的基质效应分别为94.81%～97.14%、97.89%;提取回收率分别为95.08%～95.88%、95.72%,RSD值均小于7%,符合分析要求。稳定性试验表明大鼠血浆样品在自动进样器（4℃）中放置24 h、反复冻融4个循环、-80℃下保存20天下稳定。相对于CuB原料药,固体分散体的Cmax更高、达峰时间短,CuB-PVP VA64-SD、CuB-PLX-407-SD的相对生物利用度分别为231%和386%。结论:建立的分析方法简便、可靠,可用于CuB的含量和溶出度的测定。以PVP VA64为载体制备固体分散体稳定性较好,比PLX-407为载体制备的固体分散体的稳定性明显提高。同原料药相比,PVP VA64为载体制备固体分散体的溶出度和生物利用度均提高。