目的肺癌是一种发病率、死亡率极高的恶性肿瘤。有资料显示,2000年以来我国的肺癌的发病率呈显著上升趋势,目前我国每年的肺癌死亡人数可达60万,居所有恶性肿瘤之首。肿瘤的发病机制十分复杂,多种信号通路调控肿瘤的发生。其中,磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)信号通路尤为受到关注,它可使Akt磷酸化,进而激活或抑制其下游众多靶蛋白,如Bad、Caspase9、NF-κB、p21和p27等,从而调节肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移。已有文献报道,肺肿瘤细胞中PI3K信号通路活性异常增高,而阻断PI3K通路,则可以抑制肿瘤的生长,这部分是由于阻滞细胞周期进程引起的。S期激酶相关蛋白2 (S-phase kinase-associated protein 2, Skp2)是在细胞周期调控中发挥重要作用的蛋白,它影响细胞的增殖与凋亡。Skp2最早是作为Cyclin-A-CDK2复合物的一个组分被发现，此后研究证明,Skp2也是F-box家族成员,为SCF (Skpl-Cullin-Skp2)型泛素蛋白连接酶的底物识别组分。Skp2可调控细胞的G1/S期进程,其分子机制是通过介导p21,p57,E2F1,MYC, Cyclin A, Cyclin E, Cyclin D1和p27等细胞周期调控因子的泛素依赖性蛋白降解而实现的。细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制物(Cyclin-dependent kinase inhibitor, CKI)p27是Skp2介导的主要降解底物,且只有p27的Thr-187位点磷酸化后才能被Skp2识别和泛素化降解。Kei-Ichi等报道Skp2通过泛素化机制在S期与磷酸化CyclinE相连促其降解,这可能对细胞周期S期的有序发展及保持染色体核型的稳定发挥重要作用。研究表明,Skp2在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中表达升高,与肿瘤的发生发展及预后密切相关,有癌蛋白特性,可作为肿瘤治疗的新靶点。正是对细胞周期调控相关蛋白的泛素化降解是Skp2促进G1向S期过渡和肿瘤发展的基础。但肺癌中PI3K/Akt通路对Skp2表达的调控机制及其对细胞增殖的影响却不甚明了。本实验选取四种类型肺癌细胞系H460、LK2、H446和A549作为研究对象,探讨肺癌中PI3K/Akt信号通路对Skp2蛋白的表达调控方式,及其对Skp2降解底物E2F1、p27、Cyclin E表达的影响,进而揭示PI3K/Akt信号通路对肿瘤细胞增殖、细胞周期调控的可能分子机制。方法1、细胞培养,LK2、A549细胞在含10%小牛血清的DMEM培养液、HBE、H460和H446细胞在含10%小牛血清的RPMI1640培养液、在饱和湿度、在37℃、5℃CO2孵箱中传代培养。2、细胞分组,将生长至70%汇合度的细胞分组,处理组加入PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002(浓度25μmol/L),对照组加入等体积DMSO,作用24 h后收集细胞。3、应用噻唑蓝(MTT)比色实验检测LY294002对细胞的生长和增殖情况,并绘制生长曲线,筛选LY294002的最佳作用时间。4、应用流式细胞术检测H460、LK2、H446及A549四种细胞中对照组及处理组细胞周期变化。5、应用Western-blot法检测H460、LK2、H446及A549四种细胞中对照组及实验组Skp2、p27、CyclinE、E2F1蛋白的表达变化。6、应用实时RT-PCR法检测H460、LK2、H446及A549四种细胞中对照组及实验组Skp2、p27基因的表达差异。7、应用免疫荧光法比较Skp2在肺正常细胞HBE及肺肿瘤细胞H460、LK2、H446及A549中的细胞定位差别,及LY294002处理后Skp2亚细胞定位变化。结果1、MTT法检测细胞增殖变化加入LY294002后,H446、A549、LK2、H460细胞的生长速率减慢,在24 h时四种细胞生长抑制率分别达到54.7±4.97%、55.7±3.24%、36.24%±4.56%和38.96%±3.17%。2、流式细胞术检测细胞周期进程FCM结果显示,H460、LK2、H446及A549四种细胞中,处理组的G1期细胞较对照组明显增加,而S期细胞则较对照组减少,差异均有统计学意义,表明处理组细胞阻滞于G1/S期。3、Western-blot法检测Skp2、p27、CyclinE、E2F1蛋白的表达与对照组相比,处理组Skp2蛋白在H460、LK2、H446及A549四种细胞中的表达水平明显下降(P<0.01)；p27在H446、A549细胞中表达增加,在H460、LK2中表达水平几乎不变；Cyclin E在四种细胞中表达量增加；在H460、LK2、H446细胞中,E2F1蛋白表达量下降,H446中E2F1蛋白表达量显著高于H460、LK2中,而A549中E2F1蛋白未表达。4、实时RT-PCR法检测Skp2、p27基因的表达实时RT-PCR结果显示,四种细胞中处理组Skp2基因表达均下降,而p27基因表达水平均升高。5、免疫荧光法检测Skp2亚细胞定位在HBE、H460中Skp2蛋白主要定位于细胞核,LK2、H446、A549中Skp2蛋白部分表达于细胞质；抑制剂处理后LK2、H446、A549中Skp2蛋白部分向细胞核转位,H460中核膜区及细胞质中Skp2蛋白表达增加。结论1、H446、A549中存在Skp2-p27轴调控细胞周期,而在H460、LK2中下调Skp2,但未见p27增加,这两种细胞系中p27并不是Skp2介导的降解底物。四种细胞系中E2F1、CyclinE均不为Skp2介导的降解底物。2、PI3K/Akt信号通路对Skp2转录水平调节是通过转录因子E2F1,但肺腺癌中并不通过该因子；CyclinE蛋白表达水平变化可能是由E2F1转录活性调节引起的。3、与肺正常细胞相比,肺癌中Skp2位于细胞质中的量增加；PI3K/Akt信号通路可调节LK2、H446、A549中Skp2由细胞质向细胞核转位,但H460中作用相反。4、肺癌中PI3K/Akt1言号通路能通过影响E2F1、CyclinE、p27等细胞周期调节蛋白调控G1/S细胞周期进程,影响细胞增殖。