东南景天镉耐受关键基因SaWRKY7功能鉴定

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东南景天(Sedum alfredii Hance),景天科(Crassulaceae)景天属(Sedum)植物,可以作为植物重金属超积累和耐受性机制以及适应性进化研究的重要模式植物。WRKY转录因子家族成员广泛参与多种生物和非生物胁迫调控,在植物逆境胁迫响应中起到重要的作用。本文根据东南景天的cDNA文库,分别从超积累型东南景天(hyperaccumulating ecotype(HE))和非积累型东南景天(non-hyperaccumulating ecotype(NHE))中克隆出SaWRKY7h/n基因全长,经过序列分析,镉诱导下表达模式分析,亚细胞定位、转录激活验证、以及在拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)中的异源表达,分析WRKY7转录因子在东南景天镉胁迫下作用机制,主要得到以下结论:1、分别从东南景天的超积累型和非积累型从超积累型中克隆得到SaWRKY7h和SaWRKY7n基因,开放阅读框全长均为1011 bp,均编码336个氨基酸,等电点大小均为5.03。SaWRKY7h分子式为C3006H5003N1011O1239S274,分子量为83.91 KD。SaWRKY7n分子式为C3016H5023N1011O1244S269,分子量为83.97 KD。进化树构建结果显示与拟南芥AtWRKY7最接近,因此命名为SaWRKY7h/n,属于WRKY基因家族IId类成员。2、利用实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR),对SaWRKY7h进行分析,SaWRKY7h在超积累型东南景天的各个部位均有表达,属于组成型表达且在根部表达量最高,茎其次,叶最低。在镉胁迫下,SaWRKY7h受镉诱导,根、茎、叶均有变化且在0.5 h达到最高值,根部受诱导程度最高,为初始值的13倍,茎部与叶部分别为初始值的4.5倍和3.7倍。SaWRKY7h/n转录激活活性分析中显示,两个基因均不具有转录自激活活性。亚细胞定位显示,SaWRKY7h/n在拟南芥原生质体上定位于细胞核,说明其可能在细胞核中起作用。3、通过转基因获得过表达SaWRKY7h/n拟南芥株系验证SaWRKY7h功能,表型分析显示过表达SaWRKY7h株系镉耐性弱于野生型,叶绿素荧光参数结果表明SaWRKY7转基因株系受到更严重的镉危害。DAB和NBT染色结果表明,转基因拟南芥受到更严重的活性氧毒害。镉含量和转移系数分析显示转基因株系具有较高的向地上部运输的能力且可以积累更多的镉,从而造成更大的镉毒害作用。这些结果均表明过表达SaWRKY7会引起镉离子向地上部分转运而导致更严重的镉毒害效果。4、对SaWRKY7h启动子进行分析,基于超积累型东南景天基因组数据扩增得到长1971bp的SaWRKY7h启动子序列,并命名为Pro-SaWRKY7h。筛选出转基因拟南芥阳性植株,GUS染色结果表明在拟南芥幼苗全株均显蓝色,表明该基因是一个组成型表达的基因。
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