糖尿病日益成为一种严重威胁人类健康的重大疾病。糖尿病对身体的危害主要来自其并发症,心血管疾病并发症是糖尿病患者致死的主要原因。越来越多的证据表明,活性氧和活性氮介导糖尿病心血管并发症的病理过程。蛋白质酪氨酸硝化与氧化损伤正相关。这就意味着,可以用检测蛋白质硝化的程度来反映糖尿病心血管并发症的发生和发展。本文的主要工作是,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹技术(Western blotting)检测不同病程的糖尿病大鼠心血管中蛋白质硝化情况,初步探讨蛋白质硝化与糖尿病心血管并发症的关系。完成的工作主要包括以下几方面:(1)为了确定检测糖尿病心肌中蛋白质硝化的最佳的Western blotting的试验条件,首先检测了不同硝化体系(Hemin/NO2-/H2O2、Hemoglobin/NO2-/H2O2和Fe3+/ NO2-/H2O2)催化的蛋白质-脂质体混合物中蛋白质的硝化,并探讨了脂质体和pH对蛋白质硝化的影响。最终确定了最佳的Western blotting的试验条件:①半干转膜的最佳时间是1 h 40min;②抗3-硝基酪氨酸抗体的最佳稀释浓度比为1:600;③辣根过氧化物酶标记的二抗的最佳稀释浓度比为1:3000。(2)根据体外实验确定的最佳的Western blotting的试验条件,检测了不同病程(0天、30天、60天)的糖尿病大鼠心肌匀浆中的蛋白质硝化、氧化和iNOS的水平。实验结果显示,0天和60天病程的糖尿病组蛋白质硝化、氧化和iNOS的水平增高;而30天糖尿病组蛋白质硝化、氧化和iNOS比正常组的表达减弱。并且,心肌匀浆中发生硝化的蛋白与发生氧化的蛋白并不是同一种蛋白。(3)检测了不同病程(0天、30天、60天)的糖尿病大鼠血管匀浆中的硝化蛋白质的表达情况。实验结果显示,在血管中发生硝化的蛋白种类与心肌中的类似,但是具体蛋白的种类需要用双向电泳和质谱联用技术进一步的验证。