前言：前列腺癌(prostate cancer,PC)的发病率有明显的地理及种族差异,欧美地区发病率较高,在我国,近年发病率有明显增高的趋势。发病隐匿、早期的骨和淋巴结转移及表型转换都是前列腺癌预后差的原因。因此,探索前列腺癌的发病机制、寻求早期诊断方法和有效的治疗手段等三个方面成为前列腺癌研究的热点和难点。　　 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是一种具有多种功能的细胞因子。HGF是由间质细胞衍生的细胞因子,通过自分泌或旁分泌的形式作用于数种上皮源性细胞,HGF/c-MET信号通路即被活化,通过一系列细胞信号通路,例如:促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kinases,P13K.)及信号转导和转录激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)等,调节细胞分裂、迁移和侵袭,诱导血管形成以及抑制细胞凋亡等,但HGF在调节钙内流作用中的机制仍不明确。既往研究发现前列腺癌患者血浆中的HGF水平与前列腺癌的转移及手术后复发相关,有助于预测前列腺癌的预后。　　 Ca2+做为重要的细胞内第二信使,它调节细胞的多种生物学行为,如细胞的增殖、分化和凋亡等,作为Ca2+进入细胞内的主要门户,Ca2+通道在调节细胞增殖和细胞周期方面的作用逐渐被人们认识。瞬时受体电位通道(transient receptorpotential,TRP)蛋白是一种非选择性的阳离子通道蛋白,TRPC(transient receptorpotential canonical)作为一种亚家族包括7种亚型,在哺乳动物中广泛存在,被激活时允许包括Ca2+在内的阳离子进行跨膜转运。近期研究发现,TRPC6在肝癌、胃癌、神经胶质瘤及食管癌等多种恶性肿瘤中呈高表达,且参与调节肿瘤细胞的增殖。本课题组通过系统的检测也证实TRPC6在前列腺癌中高表达,其表达与前列腺癌的组织分级、Gleason评分和前列腺外转移相关。　　 既往报道发现HGF可以诱导肾小管上皮细胞及肝癌细胞中TRPC6基因的表达增多,从而调节细胞增殖;也有报道认为HGF通过磷脂酶C(phospholipase C,PLC)/二脂酰甘油(diacylglycerol,DAG)途径激活鼠肝细胞内的钙通道使细胞内钙离子浓度增加。TRPC6的激活机制依赖于PLC信号通路中DAG及三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)的激活,被认为是最可能的钙库操纵性钙通道(store-operated calcium channels,SOC)和受体操纵性钙通道(receptor-operatedcalcium channels,ROC)的分子基础,但在不同细胞中其通道类型及发挥的作用还存在争议,且HGF对TRPC6的调控作用尚需探讨。　　 基于以上研究报告及本课题组既往研究结果,我们假设:前列腺癌中HGF诱导TRPC6的表达,二者的表达与前列腺癌的进展相关,HGF通过调控TRPC6介导的钙内流来调节前列腺细胞的增殖。我们设计实验在临床病例及前列腺癌细胞中检测二者之间的表达,探讨其可能存在的关系;在体外检测前列腺癌细胞中TRPC6通道的功能及生理学特性,探讨TRPC6在HGF诱导的细胞增殖和钙内流中的作用,从生长因子及其受体作用、细胞增殖的调控及细胞异常增殖时相关蛋白表达这三个方面来研究HGF及TRPC6在前列腺癌进展中的作用,这对明确HGF诱导细胞增殖的机制,寻找前列腺癌治疗及药物开发的靶点具有重要意义。　　 材料与方法：　　 一、实验材料　　 1、细胞株：前列腺癌细胞株LNCaP、22Rv1、Du145及PC3购于中国医学科学院基础医学研究所。　　 2、组织标本：收集2008年～2010年手术或穿刺活检的前列腺癌38例和良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)组织标本30例。　　 二、主要研究方法　　 1、酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定血中的HGF含量按照说明书配制检测所需的标准品及工作液,加入标准品及待测血清,反应后弃去板内液体,加入生物素抗人HGF抗体工作液,37℃反应60min,反复洗涤后加入亲和素-过氧化物酶复合物(avidin-peroxidase complex,ABC)工作液,反应后再次洗涤,先后加入TMB显色液及终止液,用酶标仪在450nm测定OD值,建立曲线,计算HGF浓度。　　 2、免疫组化检测HGF及TRPC6在前列腺癌及前列腺增生组织中的表达采用链霉素抗生物素蛋白氧化物酶免疫组化法(streptavidin-peroxidaseconjugated method,SP法),标本石蜡切片,HGF及TRPC6一抗孵育,4℃过夜,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)缓冲液代替一抗为阴性对照。根据各标记物的反应强度按阳性细胞所占细胞数量百分比与阳性细胞的染色强度进行评分。两者分值相加最后得分:0～3分为阴性(一),3.5～6分为阳性(+),6.5～8分为强阳性(++)。　　 3、反转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chainreaction,RT-PCR)检测TRPC6及c-MET mRNA的表达收集细胞,采用Trizol试剂提取总RNA,检测纯度及含量,反转录成cDNA,以相应的基因引物进行PCR扩增,以β-actin为内参照,电泳条带进行灰度值分析。　　 4、Western blot检测蛋白的表达收集细胞提取总蛋白,BCA法检测蛋白质含量。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,封闭,一抗孵育过夜,相应的二抗孵育,增强型化学发光(enhancechemiluminescence,ECL),拍照,以β-actin为内参照,条带进行灰度值分析。　　 5、TRPC6干扰采用小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对TRPC6进行干扰,设计TRPC6 siRNA序列,使用荧光标记质粒FAM-siRNA检测转染效率,根据筛选出的最佳条件进行RNA干扰,Western blot筛选干扰序列。　　 6、钙成像　　 细胞数约为1×105/ml播种在共聚焦皿,5μmol/l Fura2-AM37℃孵育,再用HEPES buffer saline孵育1h,在检测过程中给予1-油酰基-2-乙酰甘油(1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol,OAG)、毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg)及HGF刺激,用荧光倒置显微镜检测并记录细胞内Ca2+浓度的变化。　　 7、膜片钳检测配制电极内外液,两步拉制法制作玻璃微电极,建立千兆欧姆的高电阻封接,再稍加吸引,使电极尖端的膜片破裂,形成whole-cell模式,给予阻抗和电容补偿,保持电位-50mV,应用(-100～+100)mV,步阶10mv的电位进行电流电压曲线分析,待电流稳定后给予药物刺激,采集电流的变化。　　 8、细胞增殖实验调整细胞浓度为1×105/ml,接种在6孔板中,于24h、48h、72h及96h时收获细胞,用Codter counter细胞计数仪计数细胞并绘出生长曲线。　　 9、细胞周期检测制成浓度约为1×107/ml细胞悬液,95％乙醇固定30min,PBS冲洗后用Rnase处理15 min,用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染液作用细胞30min,流式细胞仪检测细胞周期分布。　　 10、细胞凋亡检测收集细胞,PBS洗涤,制成浓度约为1×106/ml细胞悬液,加入Annexin V-FITC,再加入PI避光孵育,流式细胞仪检测。　　 11、统计学分析采用SPSS11.5统计软件包对数据进行统计分析,以P＜0.05为判断差异显著性标准。　　 结果：　　 1、HGF及TRPC6在前列腺癌及前列腺增生组织中的表达组织标本免疫组化检测发现,良性前列腺增生及前列腺癌组织中HGF染色主要集中在间质的成纤维细胞及其周围,而TRPC6染色主要位于增生及癌变的上皮细胞浆及细胞膜上;前列腺癌组织中HGF及TRPC6表达阳性率明显高于前列腺增组织;进一步的研究发现HGF及TRPC6的表达与前列腺癌Gleason评分及临床分期有关,Gleason评分＞7的癌组织中HGF及TRPC6表达高于Gleason评分＜7的癌组织,与T1/T2期肿瘤相比较,T3/T4期肿瘤中HGF及TRPC6表达增高。　　 2、前列腺癌及前列腺增生患者血浆中HGF浓度与免疫组化检测结果相似,ELISA检测发现,前列腺癌患者血浆中HGF浓度高于较前列腺增生患者,且与前列腺癌Gleason评分及临床分期有关。应用Spearman秩相关分析证实前列腺癌组织及血浆中HGF及TRPC6表达呈正相关。　　 3、HGF受体c-MET及TRPC6在前列腺癌细胞系中的表达RT-PCR及Western blot检测c-MET及TRPC6在前列腺癌细胞中的表达。除了LNCaP细胞外,DU145,、PC3及22Rv1均检测到TRPC6的表达;同时也发现DU145与PC3表达c-MET;给予HGF刺激后,PC3及DU145细胞中TRPC6表达增多。　　 4、TRPC6干扰及检测采用siRNA对TRPC6进行干扰,结果显示干扰组1(siRNA1)及干扰组2(siRNA2)细胞中TRPC6表达下降了70％～80％,且所转染的干扰质粒特异性的针对TRPC6,不影响TRPC亚型及c-MET在细胞中的表达。　　 5、TRPC6降表达对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响采用Coulter counter粒子计数器自动计数细胞来检测TRPC6降表达对DU145及PC3细胞增殖的影响。结果显示TRPC6降表达后,siRNA1组的细胞增殖受到抑制;G2/M期细胞明显增多,磷酸化的Tyr15Cdc2明显增多,但细胞凋亡率无明显变化。　　 6、TRPC6降表达对HGF诱导的细胞增殖的影响进一步检测TRPC6降表达对HGF诱导的细胞增殖的影响,实验显示TRPC6降表达后,HGF诱导的前列腺癌细胞的增殖受到抑制,细胞停滞在G2/M期。　　 7、TRPC6通道功能检测钙成像及膜片钳检测发现OAG可以激活TRPC6通道,导致钙内流,使细胞内钙离子浓度升高,Tg不能将其激活;TRPC6通道介导一种非选择性非电压依赖性的阳离子电流,既有内向电流也有外向电流,反转电位大约在0mV;TRPC6降表达后,OAG诱导的电流减弱。　　 8、HGF对钙内流的影响HGF作用于DU145细胞后,钙成像检测显示钙内流增加,TRPC6降表达后,HGF诱导的钙内流明显减弱。　　 结论：　　 1、前列腺癌患者HGF及TRPC6表达明显高于前列腺增生患者,且与前列腺癌临床分期和Gleason评分相关;HGF受体c-MET及TRPC6前列腺癌DU145和PC3细胞中表达:HGF上调DU145和PC3细胞中TRPC6的表达。　　 2、前列腺癌细胞中TRPC6属于受体操控的钙通道;HGF通过TRPC6通道调控前列腺癌细胞的钙内流,从而调节细胞增殖。