【摘 要】
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该研究的内容是用基因工程的方法生产重组水蛭素(recombinant hirudin-2,rHV)的突变体,主要分为三部分.第一部分是高密度培养重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115/HV,并使用甲
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该研究的内容是用基因工程的方法生产重组水蛭素(recombinant hirudin-2,rHV<,2>)的突变体,主要分为三部分.第一部分是高密度培养重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115/HV<,2>,并使用甲醇诱导其表达水蛭素分泌至胞外,经SDS-PAGE和抗凝血酶活力实验分别检测目的蛋白表达量和活性.培养46小时后用甲醇诱导rHV<,2>表达,诱导36h后发酵液抗凝血酶活力达到6000ATU/ml.第二部分是建立毕赤酵母(pichia)高密度表达的重组水蛭素(rHV<,2>)分离纯化工艺.发酵液经超滤、透析、离子交换层析,分离纯化rHV<,2>目的蛋白;采用SDS-PAGE和抗凝血酶活力实验分别检测目的蛋白纯度和活性.纯化样品经SDS-PAGE电泳检测为单一条带,重组水蛭素比活性为6000 ATU/mg,纯化收率达38.6﹪.第三部分是对产品作必要的性质结构鉴定,并建立鉴定种子库,为大规模生产做准备.其性质结构鉴定主要包括:氨基酸含量分析,高效液相纯度检测,分子量测定(质谱法),N末端与C末端氨基酸残基分析,产品甲醇残留量检测,比色法测定抗凝血酶活力实验等.
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