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本文从多粘类芽孢杆菌BN1菌株中克隆出β-葡萄糖苷酶基因,以野生型基因为起点,通过定点突变按照设计的密码子优化策略提高野生型β-葡萄糖苷酶的异源表达量;再以优化后的高表达型基因为起点,通过定向进化和活性筛选策略提高野生型β-葡萄糖苷酶的催化效率;通过定点突变将已报道的可提高β-葡萄糖苷酶热稳定性的突变转移到高催化效率突变体上,得到热稳定性突变体;通过非变性凝胶电泳,分析酶的寡聚态和温度对酶寡聚态的影响;通过分析比较β-葡萄糖苷酶单个亚基间的弱相互作用,推测其活性结构单元的空间相对位置。主要研究结果如下:克隆到的β-葡萄糖苷酶基因有1434 bp,与已报道的bglA基因有4个碱基的变化,导致两个氨基酸替换:T385A和R422C。重组酶经DEAE纤维素DE-52阴离子交换柱和Ni-NTA亲和层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE检测为单一条带,分子量约52 kDa。纯化后的酶最适催化温度为35 ℃,最适pH为6.0,最适底物是邻硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷,但催化活性最高的底物是纤维二糖。此外,酶对对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷的Km/Kcat为45.1(mmol/L)-1s-1。密码子优化结果表明,那些在β-葡萄糖苷酶基因中频率较高,在大肠杆菌中使用频率很低的密码子对酶的表达量影响最大,替换为高频密码子后可以使表达量提高5～6倍。通过组合有益突变,WT-13基因型的相对表达量指数提高13倍。通过七叶苷培养基平板初筛和微孔板复筛,从突变体库中筛选到两株OD405/OD600值高的突变体。经测序,ml发生Y349H突变,突变后催化效率提高3倍;m2发生Q311R突变,催化效率提高1.7倍。动力学参数分析表明,Y349H突变主要提高了酶的催化活力,Q311R突变主要提高酶对底物的亲和力,对催化活力有负影响。结构分析表明,Y349H突变后导致分子内部的氢键变化,使分子能量升高,Q311R突变后使分子能量下降。组合突变后的热稳定性突变体m13(Y349H/E96K/A17S/N437K)在50℃的半衰期为75 min,比ml提高50倍,催化效率为73.9(mmol/L)-1s-1是野生酶的1.6倍,相对表达量指数为13.6比野生型基因提高15倍。Native-PAGE分析结果表明,β-葡萄糖苷酶在PB缓冲液中以单体、二聚体、四聚体和八聚体形式存在,单体没有催化活性。酶在低温下比较稳定,当温度升高时,四级结构首先受到破坏,多聚体解离成为单体分子,酶开始失活;温度继续升高时,单体分子的构象也受到影响,酶最终失去活性。通过对酶单体间弱相互作用的比较,发现按照八聚体结构排列的任何两个单体组成的二聚体作为β-葡萄糖苷酶的活性结构单位都存在缺陷,其中沿四重轴方向的相邻亚基组成的二聚体最符合实验事实,因此我们推测该二聚体为β-葡萄糖苷酶的活性结构单位。