生物乙醇的生产菌株必须能够耐受较高的乙醇浓度,这样才能降低生产成本,使生物乙醇经济廉价,从而有可能替代日益枯竭的化石能源和缓解不断恶化的生态环境危机。目前生物乙醇研究的主要方向之一是利用嗜热厌氧菌发酵木质纤维素原料产生乙醇。嗜热厌氧菌作为发酵菌株有很多优点：如在高温下发酵减少了污染杂菌的可能和减少了用于发酵罐降温的能量消耗。而木质纤维素因具有“不与人争粮”和“不与粮争地”的优点,也备受研究人员青睐。首先,利用本实验室从环境中筛选获得的嗜热厌氧杆菌Thermoanearobacterium sp. Rxl为出发菌株,通过紫外线诱变、化学诱变诱变和原生质体融合诱变以提高其乙醇耐受能力。研究中确定了三种诱变方式的最佳条件,Rxl最佳的紫外线诱变条件为：在厌氧培养箱中紫外灯15W,照射距离45cm,照射时间60s;最佳条件的化学诱变条件为：42℃条件下,0.5%DES处理5min,然后用25%的Na2S203处理5min终止反应；在以上条件下通过紫外诱变和化学诱变,分别获得了16株和8株可耐受6%(V/V)乙醇的菌株,比原始菌株的乙醇耐受能力均提高了100%以上。然后根据各诱变菌株的生长状态和发酵葡萄糖产乙醇能力差异,从紫外诱变筛选出一株菌株(编号U-16),化学诱变筛选出一株菌株(编号E-6),进行原生质体融合。通过双致死原生质体融合方法,最终获得了乙醇耐受能力达8%的菌株1株(编号P-2),并确定了原生质体形成最佳酶浓度组合为：青霉素酶0.8U/ml,溶菌酶0.1mg/ml:紫外灭活的最佳条件为：在厌氧培养箱中紫外灯15W,照射距离45cm,照射时间600s：高温灭活的最佳条件为：92℃,水浴处理8min。其次,利用原始菌Rx1发酵纤维素水解产生的多种糖类物质,并以原始菌、紫外诱变菌U-16、化学诱变菌E-6和融合菌P-2为发酵菌株,比较发酵葡萄糖和发酵木质纤维素材料(玉米芯和芦苇)预处理水解液的性能差异。结果表明；原始菌株能够利用纤维素水解产生的多种糖类发酵产生乙醇,在发酵2%的木聚糖时,乙醇和乙酸产量最高分别为52.7mM和19.9mM;在发酵2%的半乳糖时,乳酸产量最高为23mmM。融合菌P-2集合了多种优良性状如：乙醇耐受性高达8%,生长速度快,培养6个小时到达对数生长期,发酵2%葡萄糖最高的乙醇产量为40.6mM。稀酸预处理玉米芯的效果较好,水解液木糖含量高达169.3mM,原始菌发酵的乙醇产量为60.25mM,融合菌的乙醇产量为54.08mM。最后,利用随机引物扩增多态性DNA的方法(RAPD)对突变菌株乙醇耐性的分子机制进行了初步研究。通过对反应体系的优化,找出本实验条件下的最佳的Rx1的RAPD扩增条件为：在20μl体系下,DNA模板浓度为800ng,dNTP浓度为0.4mmM,引物量为0.4μM,Taq酶量为1.5U,Mg2+浓度为1.5mM。然后对80条引物进行筛选,发现引物s18、s69、s93、s113、s141能够较好的扩增出差异条带。最后,对RAPD扩增的差异条带进行产物纯化和测序,提交到NCBI比对,发现其中一条差异条带序列与嗜热厌氧杆菌属解糖菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)DSM571中一段编码膜上的钠钙交换体蛋白区域序列有97%的相似性。由于钙离子是细胞中关键的第二信使之一,调节细胞许多重要的生理功能,因此突变菌和原始菌的乙醇耐受的差异可能与膜内外钙离子浓度失衡相关。嗜热厌氧菌作为木质纤维素乙醇的生产菌株,限制其在现实中应用的一个主要因素是乙醇耐受能力较低。本研究利用从环境中筛选到的嗜热厌氧杆菌Rxl,确定了最佳的遗传育种条件,为嗜热厌氧菌的育种工作提供了方法和数据的支持。并通过RAPD技术,对突变菌耐受高乙醇浓度的机制进行了初步研究,为木质纤维素生产菌株的耐乙醇性能的改造提供了方向。