【摘 要】
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丹参(Silvia miltiorrhiza Bunge)是多年生草本药用植物,以根及根茎入药。是用途广泛的传统大宗药材。丹参在治疗与预防心脑血管疾病方面具有显著疗效,而丹参酮类化合物则是丹参的主要脂溶性药用活性成分,活性成分的含量是药材品质的关键指标。提高活性成分的含量,提升丹参药材品质是当下面临的重要问题之一,挖掘和解析丹参酮生物合成的调控网络,可以为丹参药材的品质提升提供理论依据。课题组前期
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丹参(Silvia miltiorrhiza Bunge)是多年生草本药用植物,以根及根茎入药。是用途广泛的传统大宗药材。丹参在治疗与预防心脑血管疾病方面具有显著疗效,而丹参酮类化合物则是丹参的主要脂溶性药用活性成分,活性成分的含量是药材品质的关键指标。提高活性成分的含量,提升丹参药材品质是当下面临的重要问题之一,挖掘和解析丹参酮生物合成的调控网络,可以为丹参药材的品质提升提供理论依据。课题组前期发现转录因子SmbHLH74通过直接抑制SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的转录,负调控丹参酮的积累。利用SmbHLH74为诱饵进行酵母筛库获得与之互作的蛋白磷酸酶SmToPP2,推测SmToPP2可能通过影响SmbHLH74的功能,参与调控丹参酮生物合成,本研究解析了SmToPP2与SmbHLH74互作调控丹参酮生物合成的分子机制。主要结果如下:1.实验室前期以丹参酮生物合成的负调控因子SmbHLH74为诱饵,进行了酵母双杂交的文库筛选。根据酵母双杂交筛选结果,从丹参中克隆了SmToPP2基因,CDS为933bp,编码310个氨基酸;表达分析结果表明其在根中高表达;亚细胞定位试验表明,SmToPP2定位在细胞核;酵母双杂交(Y2H)点对点试验、蛋白体外结合(Pull-down)试验及免疫共沉淀(Co-IP)试验验证了SmbHLH74与SmToPP2在体外及体内互作。2.为了验证SmToPP2调控丹参酮生物合成的功能,通过发根农杆菌及根癌农杆菌介导的遗传转化获得SmToPP2过表达的丹参转基因毛状根和植株,HPLC试验表明SmToPP2过表达导致毛状根中丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量显著升高,表明SmToPP2正调控丹参酮的生物合成;而转基因植株未见明显表型差异。3.为解析SmToPP2与SmbHLH74互作如何影响SmbHLH74抑制丹参酮生物合成的功能,首先进行了酵母双杂交(Y2H)分段试验,结果表明SmToPP2与SmbHLH74的C端互作,可能不影响SmbHLH74结合启动子的能力;进而利用EMSA试验证实了SmToPP2不影响SmbHLH74结合其靶基因SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1启动子的能力;进一步地,利用RT-qPCR分析了SmToPP2过表达毛状根中SmbHLH74三个靶基因的表达水平,发现SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的表达均呈现显著上调;然后,利用双荧光素酶报告基因试验证实了SmToPP2削弱SmbHLH74对SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1启动子转录活性的抑制;最后,通过Cell-free degradation试验证明了SmToPP2会促进SmbHLH74蛋白经26S蛋白酶体的降解。综上,本研究揭示了SmToPP2通过与SmbHLH74互作,削弱SmbHLH74对SmHMGR1、SmGGPPS1和CYP76AH1的转录抑制,并能促进SmbHLH74经26S蛋白酶体降解,从而正调控丹参酮生物合成的分子机制。
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