铁、锌等金属离子是细菌生长的必要微量元素,细菌通过调控铁、锌吸收系统和排放系统来调节细胞内的离子平衡。铁吸收调节蛋白(Ferric uptake regulator, Fur)和锌吸收调节蛋白(Zinc uptake regulator, Zur)是Fur金属蛋白家族两个重要成员,在许多G细菌中负调控高亲和性的铁、锌吸收系统。由番茄-辣椒疮痂病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)引起的番茄、辣椒细菌性疮痂病是番茄和辣椒的一种世界性病害。本研究采用同源重组方法对X. campestris pv. vesicatori中fur、zur基因进行了克隆,得到了两个基因的突变体(fur-m、zur-m),对两个基因的功能进行了较为全面的分析；同时研究了Fe在寄主——病原物互作中的作用；筛选出一株拮抗作用较强的内生细菌X8,研究了X8及fur突变体在番茄疮痂病防治过程中所具有的潜能。获得了以下研究结果：1.fur基因分析 以NCBI登录的番茄疮痂病菌X. campestris pv. vesicatoria 85-10标准菌株的全基因组序列为参考,fur由136个氨基酸组成,与其它几种黄单胞菌fur相比较,氨基酸同源性均为90%以上。系统发育树分析表明,Xcv中的fur与其它黄单胞杆菌相比其同源性高,尤其是和Xac(Xanthomonas axonopodis)、Xoo(Xanthomonas. oryzae pv. oryzae)、Xcr (Xanthomonas campestris pv. raphani)、Xcc (Xanthomonas campestris pv. campestris)同源性在90%以上,说明fur在黄单胞杆菌中高度保守。2.fur基因功能表达fur突变后(fur-m)其表型发生了显著的变化。突变株可以产生铁载体,增加了对铁的吸收；几乎不能产生生物膜；产生群体感应的能力明显减弱；在运动性测定中,半固体培养基中的突变体游动直径中有8.57mm,为野生型的39.5%,运动性减弱；胞外多糖(EPS)含量只有0.52 mg/mL,仅为野生型的40.2%；fur-m对链黑菌素(SNG)的敏感性明显增加,其生存数只有Ig7.46 cfu/mL,而野生型有1g11.85cfu/mL;对过氧化氢(H202)的抗性显著降低,突变体抑菌圈直径为18.12mm,生存数为lg7.68 cfu/mL,野生型直径为14.59mm,生存数为突变的104倍；菌株的生长曲线基本上呈现“S”型曲线,但fur-m的生长速度明显低于野生型。fur-m对番茄的致病性明显减弱,症状出现较晚,且不典型,病情指数由野生型的20.5降为3.2,差异显著；fur-m不能在烟草上激发产生过敏性坏死反应。fur-m在低铁浓度下吸收的铁最多,达2172.2g/g；低浓度的铁可以促进fur-m的生长,不同的金属离子对fur-m 6勺生长均有明显影响,除Mn2+之外,其它七种离子(Zn2+、Fe3+、Pb2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Cd2+)均显著抑制突变体的生长。对突变体进行互补后(fur-c),以上这些特性均得到了回补,各项表现接近与野生型。说明fur基因在Xcv中是一个全局性调节因子。3.zur基因分析及功能表达Xcv的ZUr基因的同源性在各黄单胞杆菌中较高,尤其是与Xac相比同源性达100%,Xcc-8004达89%,说明zur在黄单胞杆菌中也高度保守。zur突变后(zur-m)某些表型也发生了变化。在铁载体的产生、生物膜生成、产生群体感应的能力均与野生型相近。zur-m运动性明显减弱,其游动直径为9.60mm,是野生型的44.3%；胞外多糖(EPS)含量仅有0.70 mg/mL,为野生型的61.8%；zur-m对链黑菌素(SNG)的敏感性增加,其生存数为lg10.70 cfu/mL,约为野生型的十分之一(lg11.85cfu/mL);对过氧化氢(H202)的抗性显著降低,抑菌圈直径为17.50mm,生存数为1g9.25个/mL,而野生型直径为14.59mm,生存数为突变的102倍；菌株的生长曲线基本上呈现“S”型曲线,zur-m 6勺生长速度减缓。3种接种方法均表明zur-m对番茄的致病性减弱,不能在烟草上激发过敏性坏死反应；七种金属离子(Zn2+、Pb2+、Cu2+、 Co2+、Ni2+、Cd2+、Mn2+等)均对zur-m的生长有明显的抑制作用,且金属浓度越高其抑制作用越大。对突变体进行互补后(zur-c),部分缺失的表型可以得到了回补,接近与野生型。4. Fur、zur对其它相关基因表达的影响fur显著负调控bfd.Xcv935基因,对copB. Xcv1654、katE、zur、sufC、hrpG基因是呈现一定的负调控；显著正调控bfr基因,对fliM、pilU、sodB、sufD基因表现为一定的正调控。zur对多个基因呈现出负调控,尤其是bfd、Xcv935、sufD、sufC、pilU、Xcv1654、copB、hrpG,其中bfr和fliM表达量减少最明显。对bfr、fliM、katE、sodB基因表现为正调控。5.Fe及Xcv对番茄的影响zt (zur突变,zur-m)和ft (fur哭变,fur-m)对种子的附着能力完全不同：野生型附着量为1.9×108,而zt和ft分别为3.29x 108和1.10∏104,ft附着能力显著下降。不同浓度的铁和细菌均对番茄种子的萌发和生长有一定的作用。其中低Fe和ft有促进作用,而高铁和Y有抑制作用。不同铁浓度下,接种两种菌后番茄的POD活性均明显的升高。接种两菌株后,番茄CAT活性升高,整体活性表现为中铁下活性最高,在低铁下活性最小。各铁浓度下,三个处理的叶片SOD活性变化均在6d时活性升高,形成峰值,之后变化平缓。低铁下,ft接种后番茄PAL活性基本高于Y接种的；而高铁下则正相反。不同铁浓度下,三个处理间的MDA含量基本趋于上升,对于接种ft和Y的番茄其MDA含量顺序基本为低铁>高铁>中铁。低铁下,接种Y和ft后番茄SS含量是先升后降。中高铁下,3个处理的变化均为先降再升再降,处理基本为Y>对照>ft。中铁条件下,ft接种后的番茄Pro含量较其它浓度要高,Y的最低。高铁下,各菌株Pro含量基本变化为先降后升。各铁浓度下,三个处理的叶绿素总量变化相似,都在9d时达到最低,呈现先降后升的趋势。各处理下,胡萝卜素浓度变化较一致,9d时明显升高,12d时又明显下降。中铁下的各处理在株高、总鲜重、茎粗、叶面积均最高,接种ft的各生物量在各处理中也基本是最高的,而且ft有利于番茄叶片对铁的吸收。在高铁下接种Y后,番茄病害发生减轻,病情指数明显下降。6.生防菌X8的鉴定与生防作用 在十几种果蔬中分离到6株拮抗作用较强的细菌菌株,其中X8菌株对多种病原真菌和细菌具有较强拮抗作用。经16S rDNA序列分析,X8菌株与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的16S rDNA序列的同源性达99%。综合形态特征、生理生化特性,将X8鉴定为B. subtilis,在GenBank中序列登录号为HQ647257。利用X8和ft防治疮痂病。在保护作用中,X8的防效在21d时为42.9%,在ft防效为50.4%；在治疗作用中,X8的防效在21d时为25.3%,ft则没有防效；综合防治中,以上各处理配合上铁均能取得更好的效果,接近于药剂的防效。