结直肠癌是全球常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率均居世界前列。尽管近年来结直肠癌在诊断技术,内镜和影像学检查以及多学科综合治疗等方面取得了巨大进步,每年仍会造成数以百万的患者死亡。结直肠癌在免疫分子学研究方面取得的巨大进展提示肿瘤的免疫逃逸将成为结直肠癌治疗的一个重要障碍。因此寻找新的生物标记物对于发展结直肠癌的靶向治疗至关重要。肿瘤的发生发展受肿瘤微环境中多种因素的调控。既有正常细胞恶变过程中调节细胞功能及生长的内源性因子,也包括调控肿瘤进展和转移的外源性因素如局部浸润的免疫细胞、肿瘤细胞分泌的促炎因子及趋化因子等。基于免疫微环境对肿瘤进展和预后的重要影响,大量研究发现肿瘤细胞分泌的某些细胞因子可参与调节特定的免疫细胞亚群的局部浸润。Galectin-9作为galectins家族的一员,广泛分布于免疫系统组织(如脾脏,胸腺和外周血淋巴细胞)及内胚层起源的组织中(如肝脏,小肠,胃和肺)。大量研究已经证实galectin-9在肿瘤组织和对应的正常组织中表达存在差异。多数恶性肿瘤细胞上galectin-9的表达明显低于他们的正常对照。例如,乳腺癌,肺癌,肾癌,肾上腺癌和前列腺癌细胞系中galectin-9表达降低或缺如。对来自神经系统和卵巢的肿瘤细胞系而言,galectin-9表达的差异依赖于肿瘤细胞的亚型。Galectin-9通过多种机制,如介导肿瘤细胞的凋亡与细胞周期、粘附和转移、血管生成和肿瘤免疫逃逸,参与肿瘤的发生发展。这提示该分子有望成为一种新的肿瘤预后的生物学标记。然而,galectin-9在结肠癌中的表达特点及临床意义却知之甚少。淋巴细胞作为肿瘤微环境中的重要组成成分,影响肿瘤的进展和预后。自然杀伤细胞(Natural killer cells, NK)是固有免疫系统的主要细胞之一。在CRC肿瘤组织中,大量浸润的NK细胞与患者较好的临床预后相关。最近的一项研究发现尽管在结直肠癌肿瘤组织中NK细胞反应性细胞因子水平较高,肿瘤组织中浸润的NK细胞数目仍明显低于邻近正常组织。这提示结直肠癌肿瘤微环境中的趋化因子不足以募集NK细胞至肿瘤组织。此外,研究显示galectin-9能增加荷瘤小鼠腹膜渗出液中NK细胞的数目,提示galectin-9可能通过调节NK细胞募集参与肿瘤进展。据此我们推测肿瘤组织中NK细胞浸润数目减少可能与galectin-9表达水平的降低有关。肌动蛋白骨架的重组在细胞运动过程中是必不可少的。肌动蛋白感知并整合化学和物理信号以控制细胞运动。Rho GTPase家族蛋白通过与表面受体结合激活细胞骨架。Rho/ROCK信号通路对多种细胞骨架相关活动必不可少,如通过磷酸化下游基质调节细胞骨架,增加肌动蛋白纤维的稳定性以及产生肌动蛋白-肌球蛋白收缩性。先前研究证实galectin-8,作为与galectin-9相似的另一种半乳糖凝集素,能诱导Jurkat T细胞的细胞骨架重排。因此我们推测galectin-9可能通过该通路影响NK细胞的运动能力。T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3, Tim-3),属于Tim家族的一员,是galectin-9的主要受体之一。作为重要的调节因子,Tim-3在多种淋巴细胞和肿瘤中发挥重要作用。Tim-3可以通过多种机制调节抗肿瘤免疫反应并影响肿瘤的发生发展。现已有多个研究检测肿瘤相关免疫细胞上Tim-3的表达水平以及对肿瘤进展及预后的影响。例如,PD-1(hi)Tim-3(+)T细胞与急性髓细胞白血病(Acute myelogenous leukemia, AML)患者移植后的白血病复发强烈相关。在肾细胞肾癌中,CD4+T细胞和CD8-T细胞上Tim-3表达显著升高,且与较高的临床分期相关。此外,在黑色素瘤和肺腺癌患者中,NK细胞上Tim-3表达上调,且与疾病分期相关并预测较差的患者预后。然而到目前为止,CRC患者外周淋巴细胞亚群上Tim-3表达及临床意义尚未完全阐明。本课题在已有研究的基础上,利用免疫组化的方法深入探讨galectin-9在结肠癌肿瘤组织中的表达特点及临床意义,并分析了galectin-9表达与肿瘤组织中NK细胞浸润的相关性。通过体外实验分析galectin-9是否通过Rho/ROCK1通路调节NK细胞趋化作用的机制。此外,我们还初步探讨了galectin-9的受体Tim-3在CRC患者外周血淋巴细胞上的表达及临床意义,以期进一步补充galectin-9在结直肠癌中NK细胞免疫调节及肿瘤进展中的作用及机制。第1部分Galectin-9在结肠癌中的表达目的：检测galectin-9在结肠癌肿瘤组织中的表达情况,并分析galectin-9表达的临床意义。方法：1-患者入组：本研究回顾性纳入在山东大学齐鲁医院行手术切除的结肠癌患者128例,并收集患者的基本信息,包括性别,年龄及基本临床资料。其中,38例患者同时获取了肿瘤组织及对应的癌旁组织,用以评估两种组织中galectin-9表达差异。90例患者获取了完整的随访数据以用于生存分析。资深病理学医师对患者的组织病理学特征进行评估,并根据手术切除标本的病理学结果进行TNM分期。2.免疫组化评价galectin-9表达：我们用免疫组织化学染色的方法评估galectin-9表达,其免疫组织化学结果是基于阳性细胞的百分比及染色强度评分的。表达强度用组织学评分(ΣPi)表示。在这个公式中,p代表galectin-9阳性细胞的百分数,其中1%-10%记为1分,11%-50%记为2分,51%-80%记为3分,81%-100%记为4分。i代表galectin-9在组织中的染色强度：无染色记为0分；弱染色记为1分；中度染色记为2分；强染色记为3分。最终,ΣPi评分10-12记为强阳性(++++),7-0分记为中等阳性(++),4-6分记为轻微阳性(++),1-2分记为弱阳性(+),而0分为阴性(-)。 为了便于后期的统计学分析,我们根据染色评分的中位数进行二级评分：-/+为低表达组；++/+++/++++为高表达组。结果：1-在128例结肠癌肿瘤患者肿瘤组织中,78.91%患者galectin-9表达阳性。通过对38例患者肿瘤及癌旁组织galectin-9染色结果评估,我们发现该分子主要表达于肿瘤细胞及正常腺上皮的胞浆,但是在细胞核及细胞膜上并无表达。结肠癌肿瘤组织中galectin-9表达明显低于正常黏膜组织(p<0.001)。2.结肠癌患者肿瘤组织中galectin-9表达与TNM分期,淋巴结转移及组织学分化程度相关,但是与性别,年龄及远处转移无关。3. Kaplan-Meier分析发现galectin-9表达水平较高的患者其中位生存时间明显高于galectin-9低表达患者(p=0.012)；此外,TNM分期(Ⅰ/Ⅱ)和无淋巴结转移(N-)患者也有较好的生存。4.单因素和多因素COX分析结果提示结肠癌肿瘤组织中galectin-9表达是患者总生存的阳性预测因子。结论：Galectin-9在结肠癌肿瘤组织中表达降低,并且提示患者较差的预后。Galectin-9可作为结肠癌患者独立的预后因子。第二部分Galectin-9调节NK细胞浸润及机制研究目的：检测CD56+NK细胞在结肠癌肿瘤组织及对应癌旁组织中的浸润特点,并分析galectin-9表达与NK细胞浸润之间是否存在相关性。此外,探索galectin-9调节NK细胞趋化运动及作用机制。方法：1.免疫组化：对38例结肠癌患者肿瘤组织及癌旁组织中CD56+NK细胞的浸润数目进行评估,分析NK细胞的浸润特点及与galectin-9表达之间的关联性；对于CD56染色结果,我们在每个组织标本中选取10个以上高倍镜视野(200x)以评估CD56+NK细胞的浸润强度。其中,选择5个淋巴细胞浸润最密集的部位,计算肿瘤组织或癌旁正常大肠腺体附近浸润的CD56+细胞数目。取每高倍视野下NK细胞平均数用以后期统计学分析。我们根据四分位法将患者分为NK细胞浸润阴性,低度浸润,中度浸润和高度浸润组,用斯皮尔曼等级相关用于分析galectin-9表达与NK细胞浸润之间的相关性。2. SiRNA转染HT29细胞：通过脂质体Lipo 2000将siRNA-galectin-9及对应的阴性对照序列转染入CRC细胞系HT29中,同时用RT-PCR,免疫印记和ELISA检测转染效率；收集肿瘤培养上清。3.趋化实验：NK92细胞置于Transwell小室上层,下层则加入不同浓度的重组galectin-9或肿瘤培养上清。37℃培养4h,收集下室的细胞计数。此外,加入Y-27632和C3转移酶以检测Rho/ROCK信号通路在NK迁移中的作用。4. F-actin共聚焦成像：用重组galectin-9处理NK92细胞4h,行鬼笔环肽染色,通过使用激光扫描共聚焦显微镜观察galectin-9对NK92细胞中F-actin极化的影响。结果：1.结肠癌癌旁组织中CD56+NK细胞浸润明显高于肿瘤组织p<0.001)。此外,galectin-9高表达部位浸润的NK细胞数目明显高于galectin-9低表达组织(p<0.0001)。斯皮尔曼等级相关分析提示galectin-9表达与CD56+NK细胞浸润显著相关p<0.0001；R2=0.658)。2.HT29细胞培养上清能显著增强NK92的趋化运动。用siRNA-galectin-9转染HT29细胞后,肿瘤上清对NK92细胞趋化作用受到抑制,该抑制作用在siRNA#378和siRNA #690组达到显著统计学差异。3.重组galectin-9能显著增强NK92的趋化运动。4.趋化实验证实Y27632和C3转移酶能显著抑制NK细胞的迁移。重组galectin-9能显著增加NK92细胞中Rho家族多种分子的mRNA表达,包括RhoA, RhoB, RhoC, RhoF, RhoG, RhoH, RhoQ和RhoTl。此外,用重组Galectin-9刺激NK92细胞24小时后,ROCK1蛋白表达水平上调。5.重组galectin-9影响NK92细胞中F-actin细胞骨架的重排。6. Galectin-9能通过影响Rho/ROCK1通路相关分子表达增强原代NK细胞的趋化运动。结论：在结肠癌中,NK细胞的浸润与该部位galectin-9表达呈正相关,该分子可以通过活化Rho/ROCK1信号通路调节NK细胞中F-actin极化进而影响NK细胞的运动能力。这些结果为进一步研究galectin-9调控NK细胞募集提供了较好的研究基础,并提示该分子可能成为结肠癌免疫治疗的一个新的治疗靶点。第三部分Tim。3在结直肠癌患者外周免疫细胞上的表达及临床.意义研究目的：检测CRC患者及健康志愿者外周血中不同淋巴细胞亚群上Tim-3表达,并分析Tim-3表达与患者临床病理参数之间的相关性。方法：1.入组人群：本研究纳入了自2013年5月至2013年10月在山东大学齐鲁医院接受治疗的CRC患者89例,以及年龄与性别匹配的健康志愿者38例。2.流式细胞学检测：多色流式细胞仪分析患者及健康志愿者外周血中T细胞,NK细胞和NKT细胞分布及Tim-3表达情况。结果：1.与健康对照相比,未手术CRC患者外周血NK细胞百分比显著降低p=0.0027),但是T细胞和NKT细胞比例无显著差异(p>0.05)。2.Tim-3在NK细胞上的表达水平明显高于NKT细胞和T细胞。CRC患者外周血中Tim-3+NK细胞水平明显低于健康对照(p=0.0239)。3.外周NK细胞和Tim-3+NK细胞的水平与CRC患者的临床肿瘤分期呈负相关。与Ⅳ期患者相比,Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期患者有较高水平的循环NK细胞水平(p=0.0014)。此外,未发生远处转移的患者与远处转移患者之间Tim-3+NK细胞水平也有显著统计学差异(p=0.0218)。4.手术切除患者与未接受手术治疗CRC患者之间循环淋巴细胞百分比无显著差异。但是,手术切除患者外周血中Tim-3+NK细胞水平明显高于未手术患者(p=0.0003)。手术能显著提高患者术前外周NK细胞上较低的Tim-3表达水平(p=0.0126)。5.我们未发现NK细胞水平及Tim-3表达模式的改变与患者术前肿瘤标志物水平之间存在相关性。结论：CRC患者术前NK细胞上较低的Tim-3表达水平与疾病的进展及较差的预后临床参数相关,提示Tim-3是结直肠癌患者NK细胞上的一种生物活性标记物。至于galectin-9是否通过Tim-3影响NK细胞仍需要后期实验加以证实。小结：1.结肠癌肿瘤中低表达的galectin-9可预测患者的不良预后；并可以通过Rho/ROCK1通路调节NK细胞的浸润；2.CRC患者外周血中NK细胞水平及Tim-3表达显著降低,并且与患者较差的TNM分期相关。创新点：1.从免疫学角度,探讨了CRC肿瘤细胞来源galectin-9的临床意义及对NK细胞浸润的影响,结果提示galectin-9调节NK细胞的趋化运动。同时发现galectin-9调节NK细胞中Rho/ROCK1通路及F-actin的极化,而对于其具体机制仍有待进一步研究。2.初步探讨CRC外周血中不同淋巴细胞亚型上Tim-3的表达水平及临床意义,发现NK细胞上Tim-3表达降低且提示患者较晚的临床分期,这可能是galectin-9调节NK细胞及CRC患者肿瘤免疫逃逸的另一潜在机制。