创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder，PTSD)是由于异常威胁性或灾难性心理创伤导致出现长期持续性精神障碍，其临床表现以再度体验创伤为特征，并伴有情绪的易激惹和回避行为。简而言之，PTSD是一种创伤后心理失衡状态[1][2]。近年来，随着战争、社会暴力事件、重大交通事故和自然灾害等创伤意外的不断增多，PTSD已经成为一种普遍的精神障碍而被关注[3][4]。目前，PTSD及其神经生物学致病机制的探讨已成为涉及创伤学、神经精神病学、心理学等跨学科研究的重点[5]。　　单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)通路通过抑制能量消耗通路和激活能量再生通路，在能源动态平衡调控中起着中枢性调节作用。AMPK通路可以在生理刺激，例如运动和激素，如脂联素，瘦素等，以及病理条件下如缺糖，缺氧，氧化等情况下被激活。作为脂类和血糖代谢调节作用的枢纽，AMPK同时被认为是治疗肥胖[6-9]，Ⅱ型糖尿病和癌症的关键靶点[10-15]。一些研究表明AMPK具有神经保护作用，目前为止，还没有关于AMPK通路对PTSD的保护作用方面的研究。氧化应激损伤是创伤后引起PTSD病理变化的诱因。减少和抑制氧化应激和其所诱发的神经元调亡是目前很多对神经元保护措施的原理。SPS目前是公认的模拟氧化应激引起的神经元凋亡的动物模型[16]。本论文的目的旨在研究AMPK通路对海马神经元在氧化应激条件下的保护作用和机制。　　在我国，自然灾害时有发生，灾后一些人会出现长期焦虑与激动情绪。同时随着社会的发展、生活的节奏加快，来自外界的压力不断增大，这些均成为PTSD诱发因素。因而如何治疗PTSD是一个刻不容缓的课题。因此，本课题引用国际上公认的SPS做为PTSD动物模型来进行PTSD的基础研究，首次揭示PTSD海马细胞凋亡与AMPK通路的关系，以及AMPK通路的激动剂成为今后防治这一疾病的有效途径。　　目的:　　本研究主要通过使用本实验室有多年研究经验的SPS诱导的大鼠PTSD模型，观察Metformin对海马神经元AMPK通路的激活、线粒体、凋亡和氧化应激在蛋白和RNA水平的分子生物学影响，来研究Metformin是否有可能对PTSD有保护作用。为今后进一步进行Metformin对PTSD行为学和细胞学的影响打下坚实基础。由于分子学改变的时间周期短，本研究观察时间点局限在SPS后4天内。　　方法:　　1、模型制作及分组　　采用国际公认的SPS刺激诱发的PTSD模型[17][18]。SPS刺激是指将大鼠连续进行下述步骤处理，即:大鼠禁锢2h后，立即强迫游泳20min(水深40cm，水温25℃)。经过15min的恢复，乙醚麻醉至意识丧失，在笼子中不再经任何刺激正常饲养至取材。随机分为4组，对照组、SPS组、Metformin组、SPS+Metformin组。随后在需要的时间将大鼠安乐死后取海马组织。　　由于本研究主要聚焦于Metformin对SPS后海马神经元分子生物学的影响，因此，Metformin对海马神经元影响的实验样本的采集时间为皮下注射后0、1、2和4天。Metformin对SPS后海马神经元影响的实验样本采集时间为Metformin给药后一天，SPS在Metformin给药后一小时进行。　　2、给药方式和剂量　　根据Metformin给药的相关文献，以及本人之前在小鼠Metformin给药实验中的研究初步结果，证明采用腹部皮下注射方法可以有效降低血糖，因此在本预实验中采用了大鼠腹部皮下注射Metformin300mg、400mg和500mg每公斤体重，预实验表明在300mg和400mg每公斤的剂量没有观察到对大鼠行为有影响，500mg每公斤体重出现部分大鼠短时间的行动障碍，分析可能由于引起大鼠的血糖降低，故本实验采用400mg/kg剂量。　　3、Western blotting检测海马神经元的pAMPKa、PGC-1a和PARP　　取海马神经元的组织经匀浆、超声粉碎后高速低温离心，提取上清蛋白，电泳，转膜，经封闭后分别加一抗(MR工作浓度1∶2000)4℃过夜;HRP标记IgG(工作浓度1∶5000)孵育2h，DAB法显色，扫描各条带计算光密度值。　　4、Real-time PCR检测海马神经元的氧化应激损伤和线粒体合成相关基因。　　大鼠在完成实验后，分离海马组织，提取总RNA，进行逆转录得到cDNA，应用经过检测efficiency大于90％预先合成的引物和配套的试剂，进行real-time PCR半定量检测。　　结果:　　1、Metformin激活PTSD-SPS海马神经元AMPK通路Western Blotting分析结果显示:　　与正常对照组相比，Metformin组海马磷酸化AMPK和AMPK通路下游调节能量代谢的重要枢纽蛋白，PGC-1a蛋白表达水平明显增加，在Metformin皮下给药(400mg/kg)一天后，活化AMPK和PGC-1a表达增加到1.5倍。在给药两天后增加到2倍以上，持续给药在第三天时仍然维持在2倍左右水平，说明体内药物浓度可能达到了平台期。　　与正常对照组相比，Metformin给药后6小时和1天对比，给药6小时组活化AMPK的表达和PGC-1没有显著增加，而1天后两者均见显著上调，包括Metformin组和SPS+Metformin组，SPS组未见显著变化。　　2、AMPK通路激活对PTSD大鼠海马神经元线粒体损伤的保护作用　　Real-time PCR结果分析显示:　　与正常对照组相比，PGC-1a在给药一天后，Metformin组未见mRNA表达出现明显表达增加，但在SPS组出现PGC-1a表达水平出现显著下降，同时在有Metformin干预时，将SPS诱导的PGC-1a的表达下降阻断。　　与正常对照组相比，给药6小时后，Metformin组、SPS组、SPS+Metformin组PGC-1a mRNA表达水平均未见显著变化。　　线粒体功能相关的重要转录因子TFAM和NRF-1，均为PGC-1a调节的下游转录因子，均出现与PGC-1a表达一致的表现。即在给药一天后，SPS组出现明显降低，而Metformin的应用抑制了这种降低。　　3、Metformin促进了海马神经元线粒体DNA复制　　Real-time PCR结果分析显示:　　通过对比细胞核内特异性基因的表达和线粒体DNA特异性基因COXII的表达，可以间接检测线粒体DNA含量。给药一天后海马神经元线粒体DNA的复制出现显著增加，达到正常对照组的1.5倍左右，其后给药2天到4天增加到大约2倍水平，但1、2、4天组未见显著变化。　　4、Metformin对PTSD大鼠海马神经元的凋亡的保护作用。　　Western blotting结果分析显示:　　与正常对照组相比，Metformin组未明显改变体内细胞凋亡的标志蛋白之一，DNA修复酶，PARP蛋白水平表达，而SPS组出现了明显的表达增加，而给药Metformin后避免了SPS诱导的PARP表达增加。　　5、Metformin对PTSD大鼠海马神经元氧化应激损伤的保护作用。　　Real-time PCR结果分析显示:　　与细胞内DNA损伤和氧化应激反应相关的重要基因包括PARP14、GADD45B、TXNRD1的mRNA表达水平在不同分组的结果显示，Metformin对所有基因的表达没有明显影响，SPS可以诱导三种基因表达水平均明显上调，而给药Metfromin后有效预防了三种基因的表达增加，表明Metformin预防了SPS诱导的氧化应激损伤和细胞凋亡。　　结论:　　1、Metformin能够通过血脑屏障到达大鼠海马。　　2、Metformin可以激活PTSD大鼠海马神经元AMPK通路。　　3、AMPK通路激活保护了PTSD大鼠海马神经元DNA以及线粒体损伤。　　4、Metformin促进了海马神经元线粒体DNA复制。　　5、Metformin减轻了PTSD大鼠海马神经元的细胞凋亡蛋白上调和氧化应激损伤相关基因表达。