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宝山堇菜(Viola baoshannensis)和东南景天(Sedum alfrediii)分别是近年来在我国境内发现Pb/Cd和Zn/Cd超富集植物，在重金属污染土壤的植物修复和植物对重金属富集机理研究领域有广泛的应用潜力。本研究利用组织培养技术建立了东南景天和宝山堇菜的微繁体系，并用水溶液培养法检验再生宝山堇菜组培苗的Pb、Cd超富集特性。为探讨东南景天对Zn和Cd耐性和富集的生理机制，本研究以两个生长于浙江(ZJ)、湖南(HN)Pb/Zn矿的矿区东南景天种群和一个生长于广东(GD)正常土壤的非矿区东南景天种群为实验材料，运用溶液培养法，比较了三个种群对重金属Zn和Cd耐性、吸收和富集能力的差异；另一方面，为了解宝山堇菜对Pb的耐性/富集分子机制，本研究分别采用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)和cDNA-AFLP(complementary deoxyrilbonucleic acid amplified fi-agment length polymorphism)技术，筛选了宝山堇菜根在高、低浓度Pb诱导下差异表达的基因片段，进而对与Pb耐性与富集相关的基因克隆片段(expressed sequence tags，ESTs)进行半定量RT-PCR和Northom杂交验证。本研究的主要结果总结如下：
1.东南景天种群间对Zn和Cd耐受和富集能力表现显著差异。在1/10 Hoagland营养液中，来自矿区的HN和z，种群在Zn(2.5-40 mg 1<-1>)和Cd(0.25-2 mg 1<-1>)处理中均未表现明显受伤害症状；而GD种群在zn和Cd浓度分别为5。mg 1<-1>和0.25 mg 1<-1>时，表现明显受伤害症状。这表明，与非矿山种群(GD)相比，东南景天的矿山种群(ZJ和HN)已具有很强的Zn、Cd耐性。当溶液中Zn<2+>浓度为20 mg 1<-1>时，ZJ种群茎中zn含量达到最高值，为10136 nag kg<-1>(干物质，DW，下同)；当溶液中Zn<2+>浓度为10 mg 1<-1>时，ZJ种群叶中Zn含量达到最高值，为7792 mg kg<-1>。20 mg 1<-1>Zn处理下，HN种群茎叶中Zn含量最大，分别为9858 mg kg<-1>和8156 mg<-1>。GD种群茎叶中Zn含量均低于900 mg kg<-1>。当溶液中Cd<2+>浓度为2 mg 1<-1>时，ZJ种群茎叶中Cd含量最高，均超过5000 mg kg<-1>；此处理下，HN种群茎叶中Cd含量也最高，分别为4387 mg kg<-1>和1181 mg kg<-1>；而GD种群Cd含量不超过300 mg kg<-1>。这表明，在Zn/Cd富集能力方面，东南景天的矿山种群强于非矿山种群，其中以ZJ种群的富集能力最强。此外，所有重金属处理下，zJ和HN种群茎重金属含量/根重金属含量即茎部转运系数(TF,translocation-factor)总大于1，表明ZJ和HN种群的东南景天具有超富集Zn、Cd的能力。
2.东南景天的ZJ种群的叶外植体接种在含10μM NAA+10μM BA的MS基本培养基上，成功诱导出愈伤组织和丛生芽，平均每外植体诱导出的芽数超过10，初步建立了高繁殖系数的东南景天体外繁殖体系，但再生芽的生根及组培再生苗的移栽尚有一定困难。宝山堇菜叶外植体接种在含(2.5-10)μM NAA+(2.5-10)μM BA或(2.5-10)μMIBA+(2.5-10)μM BA的MS基本培养基上后，能成功诱导出丛生芽。2.5μM IBA+2.5μM BA和10μM IBA+5μM BA激素组合对宝山堇菜从生芽的诱导效果最好，平均每外植体诱导出的芽数分别为22.4和21.7。诱导出的芽在1/2MS培养基上成功长出根，组培再生苗能成功移植到土壤中，形态上没有任何变异，说明本次研究成功建立宝山堇菜的体外繁殖体系。
3.对宝山堇菜组培苗的重金属超富集特性进行水培验证，所有Cd处理(90-450μM)下，外植体再生苗和种子萌发苗的干重生物量、地上和地下部分富集的Cd含量均无显著差异。在所有Cd处理下，两种来源的宝山堇菜苗生长未受抑制，地上部分积累的Cd均超过100 mgkg<-1>，在450μM Cd处理时，甚至超过6500 mgkg<-1>，且根部富集的Cd总小于地上部分。这充分证明组培宝山堇菜苗未发生变异，和种子萌发宝山堇菜一样仍具有Cd超富集特性。Pb处理(100-1000μM)下，外植体再生宝山堇菜地上部分积累的Pb均超过1000 mg kg<-1>，在1000μM Pb处理时，外植体再生宝山堇菜地上部分积累的Pb最高为19543 mg kg<-1>。Pb转运系数(TF，地上部分Pb含量/根Pb含量)变化范围是0.2-0.3，符合Pb超富集植物标准，和以往对野外采集宝山堇菜进行的水培试验结果相符，说明组培宝山堇菜苗没有发生变异，仍具有Pb超富集特性。
4.为筛选高浓度Pb胁迫下宝山堇菜根中特异表达基因，以组培再生宝山堇菜为材料，以300μM Pb(NO<,3>)<,2>处理48 h的宝山堇菜根部mRNA为检测子(tester)，对照组根mRNA为驱赶子(driver)，利用SSH技术，构建宝山堇菜差异表达cDNA文库，获得27个有意义的无重复EST克隆片段，大小区间为120-890 bp。根据其功能，分为5类：1)抗氧化相关；2)胁迫蛋白；3)信号转导相关；4)代谢相关；5)未知功能片断。为筛选低浓度Pb胁迫下宝山堇菜根中特异表达基因，通过cDNA-AFLP方法得到24个大小区间为150-500 bp无重复的有意义EST克隆片段，这些片断在60μM Pb(NO<,3>)<,2>处理48 h的宝山堇菜根部上调表达。根据其功能，这些克隆片段也可分为5类，但和通过SSH方法筛选出的300μM Pb胁迫下根中差异表达的克隆片段基本没有重复。
5.不同浓度(对照、60、300、600μM Pb处理)、不同时间(对照、1 d、2 d、7 d)和不同处理(对照、Cd、Na、H<,2>O<,2>)下，对感兴趣EST克隆片段进行半定量RT-PCR和Northem杂交分析。结果显示与Lycopersicon esculentum木葡聚糖内源转糖基酶(xyloglucan endotransglycosylase，XTH)基因相似性达92﹪的PS10号克隆片段在宝山堇菜根和叶中的表达量随着Pb处理浓度延长逐渐增加，在300μM Pb处理时最大，在600μMPb处理时略有下降。处理浓度为300μM Pb时，PS10号克隆在宝山堇菜根和叶中的表达量随着Pb处理时间延长而增加，在处理7 d时最大。与Arabidopsis thaliana GTP结合蛋白基因(GTP binding mRNA)相似性达84﹪的PS13号克隆在宝山堇菜根中的表达量随着Pb处理浓度增加和处理时间(300μM Pb胁迫下)延长而逐渐增加，但在叶中表达量变化不明显。与Solanum tuberosum类甜味蛋白(thaumatin-like protein)基因相似性达85﹪的PA8号克隆在宝山堇菜根中，随Pb胁迫浓度的增加，基因的表达量增加，在300μM Pb处理时表达稳定。60μM Pb胁迫下，随处理时间的延长，其表达量逐步上升，处理时间为7 d时表达量最大。与Lycopersicon esculentum抗坏血酸氧化酶(ascorbateoxidase,AO)基因相似性为87﹪的PA9号克隆在宝山堇菜根中的表达量，随Pb胁迫浓度增加和处理时间(60μM Pb胁迫下)的延长而逐步上升。但PA8和PA9号克隆片段在宝山堇菜叶中表达量对Pb胁迫响应都不明显。此外，这4个克隆在宝山堇菜根和叶中表达量对其他胁迫(Cd、Na、H<,2>O<,2>)响应都不明显。表明这4个克隆在宝山堇菜Pb胁迫下为上调表达基因。可初步假设，Pb胁迫下，伴随有细胞壁的变化，GTP结合蛋白可能参与宝山堇菜体内Pb胁迫信号的传导，类甜味蛋白可能增加了宝山堇菜对Pb胁迫的抗性，而抗坏血酸氧化酶可能参与了活性氧平衡的调节。