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干旱可以对植物造成严重不可逆的伤害,影响植物生长发育以及作物产量。随着气候环境变化,干旱已经是当今世界所面临的全球性问题,严重影响农业生产和粮食安全。植物根系所吸收的绝大部分水分,被气孔以蒸腾作用散失,因此,揭示植物气孔运动的调控机理及信号转导网络,发掘参与植物干旱胁迫响应的功能基因并明确其作用机理,将为提高植物水分利用效率,发展高产耐旱农业提供理论指导和功能基因。本论文以模式植物拟南芥为材料,以在保卫细胞中大量表达的蛋白编码基因的功能缺失突变体为研究对象,进行干旱胁迫筛选,获得了两个参与植物干旱胁迫响应的关键功能基因,分别命名为,AtNRGAl (Arabidopsis Negative Regulator of Guard cell ABA signaling)和AtGPK1(Arabidopsis Guard cell Protein Kinase1)。采用遗传学、分子生物学、生理性状实验、电生理学、酵母双杂交等技术,对这两个基因调控气孔运动与植物抗旱性的功能进行了分子机理研究与分析。1, AtNRGAl参与气孔运动与植物抗旱性的功能研究与机理分析前期蛋白质组学、Promoter+GUS染色结果及不同组织的反转录结果均表明,NRGAl在保卫细胞大量表达。NRGAl的T-DNA插入功能缺失突变体nrgal,在干旱环境中的存活率高于Col-0；进一步的离体叶片失水实验也证明,nrgal的失水率低于野生型对照。ABA是重要的植物干旱胁迫响应激素,并参与了植物的气孔运动的调控。因此,nrgal的耐干旱性状可能与ABA调控气孔运动的过程相关。利用气孔运动实验证明,nrgal对ABA诱导的气孔关闭及ABA抑制光诱导的气孔开放均较野生型过敏感。保卫细胞电生理结果显示,nrgal的内向钾离子通道(Kin+)及慢速阴离子通道对ABA的敏感性高于野生型。为进一步证明NRGAl的功能缺失是nrgal各生理性状差异的原因,构建并筛选获得NRGAl过表达株系(NRGAl-OE-5.NRGA1-OE-7)和nrgαl/NRGAl功能恢复株系(NRGAl-C-1、 NRGAl-C-7)。nrgαl/NRGA1功能恢复株系,逆转了突变体对ABA过敏感的性状。气孔运动试验表明,过表达株系表现和突变体相反的性状,对ABA的作用变得弱敏感,相同ABA浓度处理下,过表达株系的气孔开度大于野生型和空载体对照(EV1),而且过表达株系的离子通道活性对ABA的作用也变得弱敏感。过表达株系的离体叶片失水速率大于空载体对照(EV1),且植株的抗旱能力降低,其存活率明显低于空载体对照。这些研究结果表明,NRGAl是ABA响应的负调控因子,参与保卫细胞离子通道的活性及气孔运动的调控,并进而介导了植物的干旱胁迫响应。生物信息学分析表明,NRGAl具有保守的结构域-UPF0041,与预测的丙酮酸转运体2(MPC2)具有相似的氨基酸序列,本研究通过酵母突变体功能互补的方法,证明NRGAl具有丙酮酸转运体的功能。另外,NRGAl的亚细胞定位研究结果证明,其定位于线粒体,这一定位也与之可能的生理功能相对应。以上结果表明,NRGAl在植物体内可能具有丙酮酸转运体的功能,而且作为ABA负调控因子,影响保卫细胞跨膜离子转运及气孔运动,进而引起植物对干旱胁迫做出响应。2,AtGPK1参与气孔运动与植物抗旱性的功能研究与机理分析前期的蛋白组学、GUS染色及反转录结果均表明,GPK1在保卫细胞大量表达。本研究发现GPKl两个T-DNA插入功能缺失突变体,gpk1-1和gpk1-2,具有比野生型植株更加耐干旱的性状,并对GPK1参与植物干旱胁迫响应的分子机理进行了探讨。实验结果显示,GPK1作为一个负调控因子参与ABA调控保卫细胞离子通道活性、气孔运动,进而参与植物干旱胁迫响应。离体叶片实验显示gpk1-1和gpk1-2的叶片失水率降低；同时突变体对ABA调控保卫细胞离子通道或气孔运动的过程过敏感。而且这种过敏感在功能恢复株系gpk1-1/GPK1(GPKl-C-1、 GPK1-C-4)获得恢复。进一步结果显示,GPK1过表达株系(GPK1-OE-1、 GPK1-OE-2)在气孔运动、离体叶片失水、离子通道活性实验中,都表现和突变体相反的性状,对ABA的作用变得弱敏感。亚细胞定位的研究表明GPK1蛋白定位于细胞质膜上。序列结构分析表明,GPK1属于CDPK(Ca2+Dependent Protein Kinase)钙离子依赖蛋白激酶家族成员。放射性同位素32P标记,原核表达并纯化的GPK1进行激酶活性分析发现,当钙离子存在时,GPK1具有自磷酸化活性,当去除钙离子后,激酶活性消失,从而从生化水平上证明GPK1是一个有功能的钙离子依赖蛋白激酶。为深入研究GPK1负调控植物气孔运动及离子通道的作用机制,我们利用酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库,并获得了GPK1的相互作用蛋白GIP1(GPK1Interacting Protein1)。 GIP1蛋白定位于内膜系统中,当与GPK1共转染拟南芥原生质体时,两个蛋白共定位在质膜上。体外生化实验证明,GIP1可以抑制GPK1的激酶活性,且抑制随着GIP1的浓度升高而加剧。进一步的气孔运动实验证明,GIP1过表达株系(GIP1-OE-8、GIP1-OE-14)对ABA过敏感,与GPK1突变体的性状一致。推测GIP1可能通过结合GPK1并抑制其激酶活性进而参与ABA保卫细胞信号通路。以上结果表明,GPK1属于植物CDPK家族成员,作为ABA信号通路的负调控元件,参与植物保卫细胞离子通道活性、气孔运动调控过程,并参与植物的干旱胁迫响应。在分子水平上,GPK1的激酶活性受Ca2+结合激活,并被其互作蛋白GIP1结合抑制。