研究背景胆囊癌是胆道系统常见的恶性肿瘤,恶性程度高,预后差。早期手术切除是目前唯一改善患者预后的有效手段。然而,由于胆囊癌早期无典型临床症状,无特异性血清学指标,各项影像学检查均存在一定的局限性,导致胆囊癌早期诊断困难。因此迫切期待寻找到胆囊癌的关键基因并应用于靶向治疗,提高患者生存率和长期预后。Warburg效应是肿瘤代谢的特征性表现,在许多肿瘤中表现为高效的有氧糖酵解和低效的ATP产生。在有氧糖酵解期间,LDHA将丙酮酸代谢为乳酸,为肿瘤细胞快速生长和大量物质合成提供需要的能量。在乳腺癌,结直肠癌、胰腺癌等多种肿瘤中观察到LDHA表达增加,并且与预后不良相关。LDHA敲除后乳酸水平降低,细胞活力和侵袭能力降低。体外和体内研究均表明,LDHA通过调节细胞糖酵解代谢展现其致癌活性。然而LDHA在胆囊癌中的表达水平和其参与能量代谢的过程尚少见报道。miRNA通过控制多种靶基因来调节如细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡等多种生物学行为。我们课题组的前期研究表明miRNA的异常表达与多种肿瘤的发生和进展有关。亦有研究报道表明miRNA可能通过不同的信号通路抑制或促进胆囊癌患者相关基因的表达,并可能作为致癌基因或者抑癌基因为胆囊癌的诊断和治疗提供新的策略。综上所述本研究第一部分验证LDHA在胆囊癌组织中的表达和定位情况,分析LDHA表达与患者临床特征间的相关性。第二部分首先在细胞水平,通过下调LDHA的表达或活性,观察胆囊癌细胞增殖、侵袭、成瘤能力及细胞凋亡情况,然后通过检测葡萄糖消耗、乳酸以及ATP水平,研究LDHA对Warburg效应的影响。最后通过祼鼠成瘤实验观察LDHA敲除对胆囊癌细胞成瘤能力。第三部分利用生物信息学手段综合筛选并鉴定LDHA的靶基因miR-30d-5p,在胆囊癌组织和细胞水平过验证miR-30d-5p靶向调节LDHA及其对胆囊癌生物学行为的影响。第一部LDHA在胆囊癌组织中表达及其与临床特征的相关性分析目的:研究LDHA在胆囊癌组织中表达及定位情况,分析LDHA表达与患者临床特征的关系,为进一步的胆囊癌基础研究提供临床依据。方法:通过郑州大学第一附属医院伦理委员会批准,共收集胆囊癌石蜡组织样本171例(胆囊癌样本128例,癌旁样本43例),冰冻组织7例(包含胆囊癌组织和配对的癌旁组织),石蜡标本经HE染色和免疫组化染色验证LDHA的表达情况;冰冻标本通过免疫荧光技术观察LDHA在胆囊癌细胞中的定位;通过Western blot验证LDHA在蛋白水平的表达差异。将LDHA表达情况与患者年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、病理分级、TNM分期及生存期等随访资料进行统计学分析。结果:1.LDHA表达主要位于细胞膜和细胞质中,胆囊癌组织中LDHA表达水平显著高于对应的癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.0001)。LDHA蛋白在胆囊癌组织中高表达,与癌旁组织相比,差异有统计学意义(P=0.0257)。2.相对于肿瘤TNM分期,TNM III-IV患者较TNM I-II患者,LDHA表达量更高,差异有统计学意义(P<0.0001);已经转移患者LDHA呈高表达,与未转移组相比,差异有统计学意义(P=0.0011);LDHA低表达患者生存时间远比LDHA高表达患者生存时间长,差异有统计学意义(P<0.0001)。3.LDHA表达、肿瘤TNM分期、是否转移是胆囊癌患者的独立危险因素。结论:LDHA在胆囊癌组织中高表达,定位于细胞膜及细胞质中。LDHA高表达提示患者恶性临床表型和生存期短。第二部分LDHA对胆囊癌细胞增殖、侵袭、凋亡等生物学行为的影响目的:在体外细胞水平下调LDHA表达后,观察胆囊癌细胞增殖、侵袭、凋亡情况;在体内动物模型验证LDHA敲除后对胆囊癌细胞成瘤能力的影响。方法:首先根据LDHA在胆囊癌细胞中表达情况,确定研究用细胞系。其次转染LDHA siRNA后,通过Western blot验证LDHA敲除效率,CCK-8实验和EdU染色检测胆囊癌细胞增殖能力,侵袭实验检测胆囊癌细胞侵袭能力,比色法检测葡萄糖消耗、乳酸及ATP水平。然后经FX-11处理后,Western blot验证LDHA表达情况,LDHA试剂盒检测其活性,CCK-8检测胆囊癌细胞增殖能力,侵袭实验检测胆囊癌细胞侵袭能力,克隆形成实验检测胆囊癌细胞成瘤能力,流式细胞检测胆囊癌细胞凋亡情况。最后通过祼鼠成瘤实验观察LDHA敲除后对胆囊癌细胞体内成瘤能力的影响,记录肿瘤体积和重量变化,并绘制肿瘤生长曲线,移植瘤通过HE染色及免疫组化进行验证。结果:1.LDHA在NOZ和GBC-SD两个胆囊癌细胞系高表达,转染LDHA siRNA的胆囊癌细胞LDHA蛋白表达水平明显下降,呈浓度依赖性梯度变化,LDHAsiRNA 60nmol/L的敲除效率最高。2.转染LDHA siRNA后,LDHA表达受到抑制,胆囊癌细胞葡萄摄取减少,乳酸及ATP水平降低,增殖、侵袭能力减弱,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。3.FX-11处理后,LDHA活性受到抑制,胆囊癌细胞增殖能力明显减弱,侵袭及成瘤能力明显减弱,早期凋亡率增多,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)4.LDHA敲除后胆囊癌细胞在裸鼠体内成瘤时间晚,肿瘤的体积小,生长速度慢,移植瘤通过HE染色符合胆囊癌病理特征,免疫组化提示抑制瘤LDHA低表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.LDHA敲除或FX-11处理后,胆囊癌细胞增殖能力、侵袭及成瘤能力明显减弱,早期凋亡率增多。其机制可能是通过抑制Warburg效应中的糖酵解途径降低葡萄糖消耗和ATP、乳酸水平。2.裸鼠成瘤实验证实LDHA敲除后,移植瘤成瘤时间晚,生长速度慢,LDHA呈低表达。第三部分LDHA的靶向基因miR-30d-5p筛选及鉴定目的:利用GEO数据库筛选和鉴定能够靶向调节LDHA的miRNA,并验证其对胆囊癌生物学行为的影响。方法:通过GEO数据库筛选能够靶向LDHA的miRNA,原位杂交技术验证其在胆囊癌其及癌旁组织表达情况,分析miR-30d-5p表达情况与LDHA表达、TNM分期、有无转移和预后等临床特征的相关性。过表达miR-30d-5p后在RNA水平验证LDHA mRNA表达情况,在蛋白质水平验证LDHA的表达情况,双荧光素酶报告基因证实LDHA为miR-30d-5p靶基因,CCK-8检测细胞增殖能力,克隆形成实验验证成瘤能力,侵袭实验验证侵袭能力。结果:1.miR-30d-5p在胆囊癌组织水平明显下调,差异有统计学意义(P<0.005)。miR-30d-5p表达量与肿瘤TNM分期(P=0.0066)、肿瘤有无转移(P=0.0036)、患者生存期(P=0.0328)相关。2.过表达miR-30d-5p后,LDHA mRNA表达水平和LDHA蛋白表达水平均明显下降,差异有统计学意义(P<0.005)。双荧光素酶报告证实miR-30d-5p靶向调节LDHA的表达。3.过表达miR-30d-5p后,胆囊癌细胞增殖能力、克隆成瘤能力、侵袭能力减弱,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.miR-30d-5p在胆囊癌组织中低表达,与患者TNM分期、是否转移、生存时间以及LDHA的表达相关。2.miR-30d-5p靶向调节LDHA,影响胆囊癌生物学行为。