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2002年发现的Tim-3分子是T细胞免疫球蛋白粘蛋白(Tim)家族的成员,被证实为表达于Th1细胞而不表达于Th2细胞的一个免疫分子。由301个氨基酸组成,属于Ⅰ型膜蛋白,结构上包括一个Ig样V区的N-端(富含半胱氨酸),一个富含丝氨酸和苏氨酸的粘蛋白区,一个跨膜区,以及一段胞内区。其中胞内区末端具有使酪氨酸磷酸化的结构,与跨膜信号的转导有关。随着进一步的研究,发现其对Th1细胞具有负向调控作用,并且在Th17上也发现了这一分子的表达,但表达要低于Th1细胞。进而还发现,Tim-3在自身免疫性疾病、炎症、免疫耐受和肿瘤免疫中也发挥着重要作用。现在,对于Tim-3确切的生物学意义及在相关疾病中的作用尚待进一步探讨。这不仅具有理论研究意义,还具有潜在的临床应用价值。本论文分为两个部分:1. Tim-3分子在非小细胞肺癌浸润淋巴细胞上的表达将非小细胞肺癌(non small cell lung cancer ,NSCLC)病人手术切除的癌组织及癌旁组织用Ⅳ型胶原酶消化加机械研磨的方法获取单细胞悬液,再用淋巴细胞分离液分离肿瘤浸润淋巴细胞,用相应单克隆抗体染色并用流式细胞仪检测Tim-3在肿瘤浸润T细胞上的表达。同时,对患者和正常人的外周血中的T细胞也进行检测。实验结果发现,Tim-3高表达于NSCLC组织,且明显高于癌旁组织,而在患者外周血及健康人外周血中不表达。2.人Tim-3基因的克隆、转基因细胞的构建及其生物学功能的初步研究从人外周血中分离出T细胞,将其在体外用PHA活化,48h后,收集细胞,抽提总RNA,采用RT-PCR的方法,把总RNA中的mRNA逆转录成cDNA并大量扩增目的基因。将目的基因装入pIRES2-EGFP真核表达载体中并测序鉴定。用脂质体转染技术将测序正确的重组真核表达载体转染入L929细胞,72h后,用G418筛选并最终获得了稳定表达Tim-3蛋白的L929基因转染细胞。从人外周血中分离出T细胞并体外活化,以适当数量接种于96孔板,与Tim-3转基因细胞共培养。于24h、48h、72h用MTT法测细胞增殖,并且收集细胞培养上清,ELISA检测细胞因子IL-2和IFN-r的分泌。发现,阻断Tim-3信号通路促使T细胞在体外的增殖,分泌细胞因子的增加。