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猪链球菌(Streptococcus suis, SS)能引起猪脑膜炎、关节炎、败血症甚至死亡,也可导致生猪从业人员的感染和死亡,是一种重要的人兽共患病病原体。根据荚膜多糖的抗原性差异,猪链球菌分35个血清型,其中猪链球菌2型(SS2)分布最广,分离率最高,致病性最强。猪链球菌溶血素(亦称猪溶素,简称SLY),是SS2的一种重要毒力因子。SLY阳性菌株的流行存在一定地域性,北美分离株的溶血素阳性率明显低于欧洲、亚洲分离株。提示我们溶血素在不同地域的猪链球菌的致病过程中可能发挥不同的功能。目前对溶血素的生物学功能和致病机理还不十分明确。除了可以肯定SLY能溶解多种动物的红细胞及对多种细胞有毒性作用外,对溶血素如何诱导细胞因子表达、如何在猪链球菌病(尤其在脑膜炎)的发生和发展起作用,还有待于进一步的深入研究。本研究对国内病猪中猪链球菌2型分离株的溶血素基因进行了检测及序列分析,明确了其分布及遗传变异情况；并通过原核表达全长溶血素及其生物学特性及免疫原性的研究、猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因缺失株的构建及其生物学特性与致病性分析,对溶血素的生物学功能、尤其是对其分子致病机理进行了较为深入的研究。1国内病猪中猪链球菌2型分离株溶血素基因的PCR检测及序列分析通过聚合酶链反应(PCR)方法检测29株不同年代、不同地区猪链球菌2型(SS2)国内病猪分离株的溶血素基因(sly),并将其中的5株(SS2-1、HA9801、HA0507、 JR0507和ZY05719)的sly进行克隆及序列分析。结果显示：29株菌都有sly,其中5株菌的sly的ORF的碱基数目都为1,494bp、编码497个氨基酸,核苷酸序列的同源性为99.7%～100.0%,所推导的蛋白质序列的同源性为99.8%～100.0%,其中SS2-1、 HA9801、HA0507、JR0507与国外参考株P1/7的序列完全一致。表明中国猪链球菌2型病猪分离株普遍具有sly,且基因序列极为保守。2猪链球菌2型溶血素全长基因的原核表达及其生物学特性与免疫原性研究根据猪链球菌(Streptococcus suis,SS)溶血素的基因序列,设计引物,以江苏分离株SS2-1的基因组为模板,扩增出除信号肽序列外的sly全长基因,并定向克隆到表达载体pET-32α中,转化大肠杆菌BL21(DE3)。重组菌经1mM IPTG诱导,在37℃下,4h时表达产物(分子量约为72kDa)达到高峰,表达量约占菌体总蛋白20%,表达产物在上清和包涵体中各占一半。将上清经镍柱亲和层析纯化,纯化蛋白经Western blotting鉴定呈阳性,对绵羊红细胞、鸡红细胞的溶血效价分别为1.707×105HU/mg.4.267×104HU/mg,并可引起HEp-2和Vero细胞的融合、颗粒增多和脱落。纯化蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性为83.3%(5/6)。这为进一步研究SLY致病机理和研制猪链球菌新型疫苗奠定了基础。3猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因缺失株的构建以猪链球菌2型江苏分离株JR0507为模板,分别扩增溶血素基因的569bp、559bp的上下游同源臂,以pSET3为模板,扩增了长度为1056bp的氯霉素基因,将三者依次与自杀性质粒pSET4S质粒进行连接,将连接产物转化入DH5a感受态中,构建了基因缺失载体pSET4s△SLY。然后将构建的载体pSET4s△SLY:通过电转化导入JR0507的感受态细胞中,利用氯霉素抗性进行初步筛选,并用PCR和Western blotting进行鉴定,结果成功构建了溶血素基因缺失株JR0507(△SLY),为进一步研究猪链球菌溶血素的功能奠定了基础。4猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因缺失株的生物学特性及致病性分析对构建好的溶血素基因缺失株JR0507(△SLY)与亲本株JR0507的各项生物学特性及致病性进行了比较研究。结果表明,JR0507(△SLY)已完全失去了溶血活性。与亲本株相比较,其生长特性、生化特性、对PK-15、HEp-2和PIEC细胞的粘附能力没有发生变化,但对这3种细胞的毒性作用都呈极显著下降。缺失株在全血中的存活率为(15.5+2.8)%,亲本株为(40.7+4.8)%,呈极显著下降(P<0.01)。动物致病性试验表明,△SLY对BALB/c小鼠的MLD为1.0×109CFU,比亲本株上升了10倍,同时△SLY对新西兰兔和断乳仔猪都失去了致病性。用细菌接种3D4猪肺泡巨噬细胞6h后,2株菌都不能诱导炎症相关细胞因子(IL-1β、IL-18、IL-8、IL-12和IL-10)的转录,但在接种12h后,亲本株能诱导3D4细胞表达除IL-12外的其它4种细胞因子,而△SLY仍不能诱导这些细胞因子的表达。总之,与亲本株相比,溶血素基因缺失株可引起不同动物的致病性的下降,而引起其毒力下降的原因,与其在血液中的存活能力和对细胞的破坏能力下降、促炎症因子表达减少有关。这些都进一步阐明了溶血素的生物学功能及分子致病机理,说明溶血素在猪链球菌病的发生和发展中起着重要的作用。