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背景与目的：注射用重组改构人肿瘤坏死因子(Recombinant Mutant Human Tumor Necrosis Factor for injection, rmh-TNF NC),是用PCR(聚合酶链式反应)技术,以原型肿瘤坏死因子的cDNA为模版,改造TNF基因,由151个氨基酸组成的非糖基化多肽单链,分子量为16598道尔顿。这一改构扩大了TNF-α的疗效范围,增强了其抗肿瘤的活性,提高了TNF-α结合的效率,获得了高活性、低毒性的新型重组改构人肿瘤坏死因子,简称rmh-TNF。rmh-TNF属于天然TNF-a的改构体,具有与天然TNF相似的生物学活性,它不仅有效杀伤多种肿瘤细胞,而且对正常细胞(受体选择性)无细胞毒作用,且具有较明显的化疗增敏作用。rmh-TNF是新近进入临床的国家一类新药,主要临床适应症是晚期非小细胞肺癌和非霍奇金氏淋巴瘤,尚未见对于消化道肿瘤尤其是胃癌的实验研究报道。目前胃癌仍然是世界第二位癌症死亡原因和第四位高发的癌症,每年约有650000死亡病例和880000新增病例,几乎有2/3是发生在发展中国家。本研究目的是通过检测人胃癌细胞BGC-823和人脐静脉内皮细胞HUVEC-12增殖和凋亡情况,及血管形成能力、克隆形成能力和迁移能力的变化,及对人胃癌裸鼠移植瘤模型的治疗作用,研究rmh-TNF治疗人胃癌方面主要药效学,并通过蛋白印迹法和免疫共沉淀初步探究其作用机制。方法：体外培养人胃癌细胞BGC-823和人脐静脉内皮细胞HUVEC-12,分别用不同浓度rmh-TNF和TNF-a处理,并设对照组。MTT检测细胞增殖情况,Annexin V-FITC/PI和TUNEL法检测细胞凋亡情况。流式细胞仪分析细胞的周期分布和凋亡率。小管形成实验检测HUVEC-12血管生成能力的变化。软琼脂克隆形成实验及划痕法检测BGC-823克隆形成能力和迁移能力的变化。建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,分为rmh-TNF、TNF-a及阳性对照(5-Fu)和阴性对照(生理盐水)组进行治疗性实验,绘制移植瘤生长曲线,计算瘤质量抑制率,观察其对皮下成瘤能力的影响,观察生存时间和生命延长率,一般情况及解剖学变化,HE染色观察肿瘤组织病理改变,CD34免疫组化检测肿瘤组织内微血管密度(MVD)。蛋白质印迹法检测BGC-823细胞中Procaspase-3, Bcl-2和Bax的表达情况。免疫共沉淀检测rmh-TNF与DR5间是否有相互作用。结果：MTT结果显示rmh-TNF能抑制BGC-823细胞和HUVEC-12细胞增殖,呈现良好的时效关系和量效关系,其IC50值约为TNF-α的1/2-3/4,差异有显著性(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI及TUNEL实验结果均表明rmh-TNF有诱导细胞凋亡的作用,呈剂量依赖性。rmh-TNF和TNF-α处理后两种细胞周期分析均出现S期细胞增多而G0/G1期和G2/M期细胞减少,凋亡率增高,且呈现剂量依赖性。小管形成实验显示rmh-TNF对血管形成有抑制作用,软琼脂克隆形成实验和划痕法证实rmh-TNF对BGC-823细胞的克隆形成及迁移能力有抑制作用。皮下移植瘤模型构建成功,肿瘤生长曲线显示rmh-TNF组瘤体生长明显受到抑制,rmh-TNF组瘤质量抑制率为83.13%。rmh-TNF组,TNF-α组和阳性对照组生命延长率分别为85.18%,62.34%,及59.88%,阴性对照组荷瘤裸鼠一般情况明显较治疗组和阳性对照组差,各组裸鼠解剖学检查均未发现除移植瘤以外的其它器官、系统病变。HE染色病理组织学检查发现实验组和阳性对照组肿瘤组织有明显的凋亡和坏死形成,癌细胞的异型性明显减小,CD34免疫组化显示MVD明显减小,其中rmh-TNF组较其他各组减小更为明显(P<0.05)。蛋白印迹法发现BGC-823细胞中rmh-TNF组较对照组中Procaspase-3和Bax的表达明显上调,而Bcl-2的表达明显下调,且有剂量依赖性。免疫共沉淀证实rmh-TNF和DR5间存在相互作用。结论：1.rmh-TNF对于体外培养的人胃癌细胞BGC-823和人脐静脉内皮细胞HUVEC-12具有抑制增殖,诱导凋亡的作用,且较TNF-α更明显,差异有显著性(P<0.05)；2.rmh-TNF能抑制HUVEC-12的血管生成能力和BGC-823的克隆形成能力,且较TNF-α更明显,差异有显著性(P<0.05),对BGC-823的迁移能力有抑制作用；3.人胃癌细胞BGC-823在BALB/c-裸鼠皮下有良好的成瘤性；4.rmh-TNF对人胃癌细胞BGC-823 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型有治疗作用,能抑制皮下移植瘤生长,延长荷瘤裸鼠生存时间,且较TNF-α更明显,差异有显著性(P<0.05);5.rmh-TNF能够导致人胃癌细胞BGC-823BALB/c裸鼠皮下移植瘤出现凋亡和坏死,并对移植瘤中的血管生成有抑制作用,且较TNF-α更明显,差异有显著性(P<0.05);6.rmh-TNF可能通过使Procaspase-3表达上调并裂解激活,并使Bcl-2表达下调,Bax表达上调,Bax/Bcl-2值上升,从而发挥其促凋亡作用；7. rmh-TNF可能通过与DR5结合而发挥其生物学作用。