论文部分内容阅读
OguCMS是甘蓝中应用最为广泛的雄性不育类型，前期表达谱分析表明BoMF1在OguCMS花药中表达下调达5.2倍，BoMF2在OguCMS花药中表达上调达12.4倍。本试验是在本实验室前期得到的甘蓝胞质雄性不育（OguCMS）基因BoMF1、BoMF2和orf138的基础上，对其进行克隆分析，通过运用过表达技术，构建了BoMF1、BoMF2过表达载体，并对拟南芥进行遗传转化，验证其具体功能；同时利用酵母双杂交技术构建了orf138及其上下游基因142、43138的酵母诱饵载体pGBKT7-orf138-X(X=0,1,2)，通过转化酵母菌AH109验证其自激活及毒性作用，为筛选甘蓝cDNA文库夯实基础。研究结果如下：1.以甘蓝OguCMS不育基因为模板，克隆得到BoMF1和BoMF2基因，用Blast分析，分别与拟南芥基因At2g63060和At2g42940有88%和78%的同源性。同时，构建了植物过表达载体PBI121-BoMF1和PBI121-BoMF2，并成功的将其导入拟南芥中，转化率分别为1.6%和1.45%。通过对T2代转基因拟南芥植株表型的观察，发现BoMF1转基因拟南芥的花蕾基部有明显的花结构，柱头短小畸形，而且种子有败育现象；BoMF2转基因拟南芥的柱头短小畸形，种子败育现象明显，而且种荚内种子排布疏松，有种荚内无种子的现象。以上性状表明BoMF1和BoMF2转基因拟南芥出现部分不育的现象，说明基因BoMF1和BoMF2导致雄性不育。2.以甘蓝OguCMS不育基因为模板，克隆到orf138-X(X=0,1,2)基因，用DANMAN比对，与原有序列完全匹配。利用酵母双杂交技术，构建了酵母双杂交转录因子BD区诱饵载体pGBKT7-orf138-X(X=0,1,2)，将其成功的转入酵母菌AH109中并进行了诱饵载体自激活及毒性作用检测。结果显示：AH109[pGBKT7-orf138-X(X=0,1,2)]在SD/-Trp/x-a-gal平板上均长出乳白色菌落，在SD/-Ade/-Trp/x-a-gal、SD/-His/-Trp/x-a-gal平板上均未长出菌落，表明诱饵载体pGBKT7-orf138-X (X=0,1,2)不能自主激活酵母菌AH109的报告基因MEL1、ADE2、HIS3，说明其没有自激活作用。同时在SD/-Trp液中培养16h后，OD600的平均值分别为1.059、1.200、1.151，都达到了0.8以上，说明诱饵载体pGBKT7-orf138-X(X=0,1,2)对酵母菌AH109没有毒性作用，可以用于甘蓝cDNA文库的筛选。