论文部分内容阅读
小分子DSF （Diffusible Signal Factor）介导的群体感应（Quorum sensing, QS）系统在黄单胞菌的侵染和致病过程中具有关键作用,但DSF调控的外泌蛋白的种类和功能仍不清楚。由稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc）引起的水稻细菌性条斑病是我国水稻生产上一种重要的细菌病害。本研究以Xoc为对象,研究受DSF调控的外泌蛋白的种类、致病功能及机制,研究结果如下：（一）本实验室赵延存博士的前期研究中鉴定了Xoc中受DSF调控的53个外泌蛋白（赵延存论文,2011）。本研究选取了其中15个感兴趣的目标蛋白用于后续研究。这15个蛋白的功能涉及小分子蛋白介导的群体感应、细胞结构、细胞进程、氧化压力环境的适应、中间代谢、蛋白降解以及功能未知的蛋白。采用基因定向缺失技术,对这15个蛋白的编码基因进行敲除,获得相应的基因缺失突变株。致病性测定显示其中4个突变株显著削弱了Xoc对寄主水稻的致病性,其对应的蛋白/基因分别是XOC0319（Ax21同系物,依赖XA21的水稻免疫激发子）、XOC2128（多聚半乳糖醛酸酶）、XOC3806（蛋白酶）和XOC1601（半胱氨酸蛋白酶）。表型分析表明,这4个基因对Xoc的定殖能力、胞外多糖产量、游动性、生物膜的形成、胞外蛋白酶活性、抗氧化压力等毒力相关表型造成了不同程度的影响。具体结果如下：这4个基因的突变没有影响Xoc的生长速率,但影响了Xoc在水稻中接种发病后的定殖量,同时还均降低了胞外多糖的产量。XOC2128和XOC1601的突变减弱了菌体游动性,XOC0319的突变减弱了生物膜的形成,XOC3806和XOC1601的突变减弱了胞外蛋白酶活性,XOC3806和XOC2128的突变使Xoc的抗氧化压力能力有所增强。荧光定量显示这四个基因在Rs105△rpfF的表达水平在一定程度上取决于培养基的营养状况,相关结果和Rs105△rpfF中差异蛋白表达情况不完全一致；同时我们还发现这四个基因对10个已知的致病相关基因存在一定的转录调控作用。xpsE是Ⅱ型分泌系统关键基因,荧光定量PCR还显示Rs105△rpfF中xpsE的转录表达水平显著下降,说明DSF群体感应系统对Ⅱ型分泌系统的功能存在某种程度的调控作用。此外,Ax21（水稻XA21先天免疫激发子）是Xoo泌出的能在依赖XA21的水稻上激发先天免疫的硫化蛋白,并且Ax21还被认为是Xoo中一种新型群体感应的信号分子；XOC0319就是Ax21在Xoc的同系物,本研究说明这两种QS系统的功能很可能存在交叉和联系。本研究是黄单胞菌中第一次对受DSF介导的群体感应调控的外泌蛋白及其功能进行了系统深入分析,相关结果显示了DSF型群体感应系统对11分泌系统毒力因子及AX21介导的群体感应有重要的调控作用,进一步明确了Xoc中DSF型群体感应系统的功能。（二）病原菌在寄主表面的黏附性是其成功侵染的先决条件,主要在细菌黏附、定殖等侵染早期进程中起重要作用,而这个过程是由被称为黏性因子的蛋白质来完成的。因此我们选择了T5SS泌出的两个非菌毛黏性蛋白XadA、YapH进行研究,对相关基因xadA、yapH进行了缺失敲除,并对它们的致病机制及其与DSF型群体感应系统的关系进行了试验和分析。XadA和YapH是通过V型分泌系统泌出的两个黏性蛋白。我们找到了xadA、yapH的同系物,即XOC、808、XOC、2467,然后构建了缺失突变体△xadA、△yapH。致病相关表型的测定的结果显示这两个黏性蛋白均和Xoc的喷雾接种时的致病性、水稻叶片表面黏附性、胞外多糖合成能力相关,但与非生物表面的黏附性无关。实时定量荧光PCR表明,xadA、yapH的在模拟植物汁液的培养条件下的转录表达水平的变化存在差异,其中yapH能够被这种培养基诱导表达；xadA、 yapH的转录表达受DSF型群体感应通路调控的模式不同,其中yapH受rpfF、clp正向调控,xadA受rpfF、clp负向调控,说明DSF群体感应系统很可能与外泌黏性蛋白功能的发挥密切相关。本研究首次为XadA、YapH在Xoc致病过程中的作用和特点提供了参考。