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目的:脑出血(Intracerebral hemorrhage ICH)是神经内科多发疾病,有较高的死亡率及致残率,严重危害患者生活质量。神经突触重塑与ICH后神经功能恢复密切相关,且相当长时间内都可受到调节,有利于受损神经功能的恢复。凝血酶属于丝氨酸蛋白类水解酶,体内外实验均发现不管是在生理条件下还是病理条件下凝血酶都可调节神经突触可塑性,可使受损突触重建突触关系,促进神经功能恢复。本实验通过不同程度抑制血肿周围凝血酶活性后观察ICH后血肿周围突触素(Synaptophysin,SYP)和突触后致密物-95(Post synaptic density,PSD-95)蛋白的变化情况以及通过抑制凝血酶受体-1(proteinase-activatedreceptor-1 PAR1)活性后观察血肿周围SYP和PSD-95蛋白的变化情况,探讨凝血酶对实验性ICH大鼠神经突触重塑的影响及其可能机制。方法:1.根据《大鼠脑立体定向仪图谱》以右侧基底节区尾状核(前囟前0.2mm,中线右侧旁开3.0mm)为注射点,采用断尾取自体血法制作ICH模型。按照Zea-longa评分标准,将评分在1-3分之间的SD大鼠入选为实验大鼠;2.动物的分组及处理:实验动物随机分为假手术组(Sham组)、ICH组、ICH+小剂量水蛭素组(SH组)、ICH+大剂量水蛭素组(LH组)、ICH+PAR-1抑制剂SCH79797组(PI组),再按时间点将Sham组、ICH组、SH组、LH组、PI组分别分为术后3d、7d、14d、21d共4个亚组,每个亚组各5只大鼠。实验动物共100只具体处理如下:(1)Sham组向右侧基底节区尾状核注入50ul+10ul生理盐水同时腹腔注射2ml生理盐水(2)ICH组向右侧尾状核注入不抗凝自体血50ul+10ul生理盐水同时腹腔注射2ml生理盐水(3)SH组向右侧尾状核注入不抗凝自体血50ul+水蛭素3U(溶于10ul生理盐水)同时腹腔注射2ml生理盐水(4)LH组向右侧尾状核注入不抗凝自体血50ul+水蛭素5U(溶于10ul生理盐水)同时腹腔注射2ml生理盐水(5)PI组向右侧尾状核注入不抗凝自体血50ul+10ul生理盐水同时经腹腔注射PAR1抑制剂SCH79797(25ug/kg,溶于2ml生理盐水);3.标本提取及检测:3d、7d时间点的实验动物直接处死,14d、21d时间点的实验动物先行神经功能评分后再予以处死。在相应时间点麻醉大鼠,并灌注、固定取脑,制作脑组织切片。用HE染色观察血肿周围脑组织基本形态和结构,用Garcia神经功能评分法评价神经功能缺损情况,用免疫组化法检测各时间点血肿周围SYP和PSD-95蛋白表达。结果:1.HE染色观察各组脑组织病理改变:(1)Sham组,无血肿形成,各时间点脑组织结构完整;(2)ICH组3d时血肿周围可见大量血细胞,脑组织结构紊乱,大量炎症细胞浸润,神经细胞水肿严重甚至变性坏死,7d、14d时病灶周围血细胞逐渐减少,炎性细胞数逐渐减少,神经细胞水肿程度减轻,到21d时病灶周围血细胞更少甚至消失、炎症细胞几乎消失,纤维组织及胶质细胞增生,受损的组织结构有所恢复。与ICH相比,SH组、LH组各时间点的水肿程度及神经细胞变性坏死都有所减轻,受损组织修复都较ICH组好,且SH组的炎性细胞浸润最少、细胞水肿程度最轻,受损组织修复程度也是最好;与ICH组相比,PI组各时间点的水肿程度及神经细胞变性坏死较ICH组加重,受损组织修复程度较ICH组差。2.神经功能评分:各实验组大鼠于术后14d、21d时间点处死前予以神经功能评分,其中(1)Sham组未见明显神经功能缺损情况,ICH组、SH组、LH组、PI组都有不同程度神经功能缺损且14d时神经功能评分均低于21d(P<0.05);(2)各时间点SH组、LH组神经功能评分高于ICH组,且SH组又高于LH组,均具有统计学差异(P<0.05);PI组各时间点神经功能评分低于ICH组,具有统计学差异(P<0.05)。3.血肿周围脑组织SYP蛋白含量测定:(1)Sham组仅有少量SYP阳性蛋白表达,各个时间点无明显差异(P>0.05);(2)3d时间点ICH组、SH组、LH组、PI组仅有少量SYP阳性蛋白表达,与Sham组比较无明显差异(P>0.05);7d、14d、21d时间点,各组SYP阳性蛋白表达明显多于Sham组(P<0.05);(3)7d、14d、21d时间点,SH组、LH组SYP阳性蛋白表达明显高于ICH组,而SH组阳性蛋白表达又明显高于LH组,均具有统计学差异(P<0.05);7d、14d、21d时间点PI组SYP阳性蛋白表达低于ICH组(P<0.05);(4)ICH组、SH组、LH组、PI组各组从3d后SYP阳性蛋白增多,14d达峰值(P<0.05),之后表达下降,但到21d时血肿周围仍有较多表达。4.血肿周围脑组织PSD-95蛋白含量测定:(1)Sham组仅有少量PSD-95阳性蛋白表达,各个时间点无明显差异(P>0.05);(2)3d时ICH组、SH组、LH组、PI组仅有少量PSD-95阳性蛋白表达,与Sham组比较无明显差异(P>0.05),7d、14d、21d时,各组PSD-95阳性蛋白表达明显多于Sham组(P<0.05);(3)7d、14d、21d时间点,SH组、LH组PSD-95阳性蛋白表达明显高于ICH组,而SH组又明显高于LH组,均具有统计学差异(P<0.05);7d、14d、21d时间点PI组PSD-95阳性蛋白表达低于ICH组(P<0.05)。(4)ICH组、SH组、LH组、PI组各组从3d后PSD-95阳性蛋白增多,14d达峰值(P<0.05),之后表达下降,但到21d血肿周围时仍有较多表达。5.各组大鼠神经功能评分与SYP、PSD-95蛋白含量行相关性分析:(1)14d时,ICH组、SH组、LH组、PI组的SYP蛋白含量与相应实验大鼠神经功能评分呈正相关(r=0.948,P<0.001);(2)14d时ICH组、SH组、LH组、PI组的PSD-95蛋白含量与相应实验大鼠神经功能评分呈正相关(r=0.925,P<0.001)。结论:1、采取不抗凝自体血注入法制作大鼠脑出血模型方法较简单,易于操作,且与临床上人体自发性脑出血的病理变化过程相似,是比较理想的研究脑出血的动物模型;2、脑出血后血肿周围SYP、PSD-95蛋白含量增多,利于神经功能恢复;3、凝血酶能促进脑出血后血肿周围神经突触重塑,利于神经功能恢复,且适量的凝血酶可使神经突触重塑更明显;4、凝血酶促进血肿周围神经突触重塑可能通过PAR1途径介导;