【摘 要】
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目的:研究miR-373及SRCIN1在神经母细胞瘤（NB）组织和NB细胞系中的表达变化,探讨其在NB细胞增殖,迁移和侵袭中的主要作用和分子作用机制,为寻找新的NB治疗靶点提供方向和实验基础。方法:1.自2013年至2016年间在深圳市儿童医院收集20例高危NB和20例低危NB。采用q RT-PCR检测miR-373在高危NB组织和低危NB组织中的表达情况。2.采用q RT-PCR法检测miR-3
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目的:研究miR-373及SRCIN1在神经母细胞瘤（NB）组织和NB细胞系中的表达变化,探讨其在NB细胞增殖,迁移和侵袭中的主要作用和分子作用机制,为寻找新的NB治疗靶点提供方向和实验基础。方法:1.自2013年至2016年间在深圳市儿童医院收集20例高危NB和20例低危NB。采用q RT-PCR检测miR-373在高危NB组织和低危NB组织中的表达情况。2.采用q RT-PCR法检测miR-373在5种不同人NB细胞系IMR-32、KELLY、LAN-5、SK-N-BE（2）和SH-SY5Y中的表达情况。3.选取两株miR-373相对表达较高的NB细胞系SK-N-BE（2）和SH-SY5Y进行细胞功能实验。将antimiR-373慢病毒感染SK-N-BE（2）和SH-SY5Y细胞构建miR-373低表达稳转株。采用MTT法、流式细胞仪和流式Annexin V染色法、Transwell迁移和侵袭法检测miR-373对NB细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。4.构建miR-373低表达SK-N-BE（2）稳转株,皮下注射到NOG小鼠,观察miR-373低表达对NB细胞皮下成瘤能力的影响。采用免疫组化检测各组Ki67表达情况,进一步验证miR-373低表达对NB增长的影响。5.运用miRanda、Target Scan和Pic Tar生物信息学预测软件对miR-373进行靶基因预测,综合文献和miR-373对NB细胞功能分析,筛选出SRCIN1为miR-373的一个潜在的下游靶基因。运用双荧光素酶报告基因验证miR-373与SRCIN1直接相结合的活性。运用q RT-PCR和western blotting检测miR-373低表达和过表达NB细胞中SRCIN1 m RNA和蛋白表达水平。运用q RT-PCR检测20例高危NB组织和20例低危NB组织中SRCIN1 m RNA表达水平。采用Pearson’s correlation分析miR-373与SRCIN1在NB组织中表达水平之间的相关性。6.通过si RNA沉默miR-373,使SK-N-BE（2）和SH-SY5Y稳转株中SRCIN1基因低表达,采用MTT法、流式细胞仪和流式Annexin V染色法、Transwell迁移和侵袭法检测SRCIN1的沉默对NB细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结果:1.miR-373在高危NB中的表达水平明显高于低危NB组。2.miR-373在不同人NB细胞株之间表达量有差异。其SK-N-BE（2）和SH-SY5Y细胞中的miR-373表达量较其它细胞株表达量更高。3.antimiR-373慢病毒感染NB细胞后,细胞中的miR-373表达量明显下调。下调miR-373表达能够明显抑制细胞活性、细胞周期、迁移和侵袭能力,并诱导细胞凋亡。4.体内实验表降低明,miR-373低表达能够NB细胞的NOG小鼠成瘤能力,缩小移植瘤体积,减轻瘤重,下调组织的中miR-373和Ki67的表达量。5.双荧光素酶报告基因实验证实了miR-373能够结合SRCIN1 3′UTR,从而对其起负向调控作用。miR-373过表达能够降低SRCIN1 m RNA和蛋白表达水平,然而miR-373低表达能够增加SRCIN1 m RNA和蛋白表达水平。q RT-PCR实验结果表明SRCIN1在高危NB组织中的表达量明显低于在低危NB组织中的表达量。Pearson’s correlation分析表明miR-373与SRCIN1在NB组织中的表达量呈负向相关性。6.通过si RNA沉默miR-373,使SK-N-BE（2）和SH-SY5Y稳转株中SRCIN1基因低表达,能够增加细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力,以及降低细胞凋亡率,从而使miR-373低表达对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用被抵消。结论:1.miR-373在NB组织和细胞系中呈现高水平表达。2.体内及体外实验均证实,miR-373低表达能够抑制NB细胞增殖,降低细胞迁移和侵袭能力,以及促进细胞凋亡。3.miR-373通过负性调控其靶基因SRCIN1的表达,从而促进NB细胞活性、细胞周期、迁移和侵袭,和抑制细胞凋亡。4.SRCIN1及miR-373有望成为治疗NB的新靶点。
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