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抑制巨噬细胞(MΦ)的吞噬体与溶酶体融合是结核分枝杆菌(Mtb)逃避免疫系统杀伤和在机体内长期潜伏的主要机制。近年的研究发现,Mtb感染后可诱导MΦ内的一种富含色氨酸天冬氨酸膜蛋白(Tryptophan-aspartate containing coat protein, TACO)迅速分布并局限于含活Mtb的吞噬体的膜上,阻断Mtb吞噬体与溶酶体的融合。进一步的研究发现,TACO是被吞噬的Mtb在MΦ内生存必不可少的条件,阻断TACO的表达可有效促进Mφ吞噬体与溶酶体的融合,从而提高巨噬细胞杀伤和清除Mtb的能力。因此,通过某种有效而特异的手段抑制MΦ内TACO的表达可能是一种清除体内Mtb最为直接和有效的办法。本研究构建了MΦTACO基因特异性小干扰RNA (siRNA)的真核表达质粒,通过特异性RNAi (RNA interference, RNAi)抑制MΦ内TACO的表达,并且利用经过基因改造的耻垢分枝杆菌Msl-2c作为载体,使其在MΦ内定位表达TACO mRNA特异性的siRNA,通过RNA干扰技术高效特异地抑制TACO表达,从而清除体内的Mtb,为进一步利用siRNA研究基因的功能及治疗结核病奠定了基础。第一部分TACO特异性siRNA真核表达质粒的构建目的：构建针对TACO基因的特异性siRNA的真核表达质粒,为后续的研究奠定基础。方法：参照invitrogen公司在线设计siRNA软件设计三对互补的单链DNA,包括siRNA的正义链和反义链,并且设计了一组对照序列。在互补单链中间连有loop环,loop环两侧为21bp的以正反向组合的干扰序列,两端为BamHⅠ和BbsⅠ酶切位点的粘性末端。针对这些筛选的siRNA序列,合成该序列的OligoDNA,经退火形成双链DNA,与经BamHⅠ和BbsⅠ双酶切后的pGPU6/ GFP/Neo载体连接,构建pGPU6/GFP/Neo-taco(简称pST)干扰质粒。转化大肠杆菌后,挑取重组阳性克隆进行酶切鉴定和测序鉴定。结果：经限制性内切酶酶切和DNA测序结果证实,siRNA核苷酸序列正确插入到表达载体pGPU6/GFP/Neo中,成功构建了TACO基因特异性的siRNA表达质粒pST1、pST2、pST3及对照siRNA表达质粒pST4。结论：成功构建了针对TACO基因干扰序列的表达载体pST。第二部分siRNA真核表达质粒在细胞内的表达及其抑制TACO表达效果的检测目的：将干扰质粒pST1、pST2、pST3和对照质粒pST4转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7和293T细胞,在细胞水平检测TACO的表达变化。方法：采用RT-PCR方法自小鼠巨噬细胞系RAW264.7中扩增获取taco基因片段,并将之克隆入真核表达质粒pQE30中,构建重组质粒pQE30-taco。以pQE30-taco作为标准物建立荧光定量PCR法检测taco基因水平的标准曲线。在此基础上,本部分研究采用了三种不同的方法对taco特异性siRNA表达质粒对巨噬细胞TACO表达的影响进行了研究：(1)采用pST1、pST2、pST3、pST4转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,分别采用荧光定量RT-PCR和免疫印迹法在mRNA和蛋白水平检测巨噬细胞的TACO表达变化。但由于RAW264.7细胞转染效率低下,pST1、pST2、pST3、pST4转染后荧光定量RT-PCR和免疫印迹法均未检测到TACO的表达有明显的改变。(2)采用pST1、pST2、pST3、pST4转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,然后以TACO特异性抗体为一抗,红色荧光蛋白标记的二抗对细胞进行免疫荧光染色,在单细胞水平比较获pST质粒转染(表达绿色荧光蛋白)和未获转染的细胞的红色荧光的荧光强度,评价siRNA表达质粒对TACO表达的影响。(3)利用293T细胞转染效率高,本身不表达TACO的特点,构建TACO与红色荧光蛋白(RFP)表达基因的融合基因表达质粒：pCDNA3.1-Red-taco(简称p3.1-RT),用p3.1-RT和TACO特异性siRNA表达质粒共转染293T细胞,再采用免疫印迹方法检测TACO的表达改变。结果：转染RAW264.7细胞后荧光定量PCR和western blot图片表明没有明显的差异。在pST干扰质粒转染RAW264.7细胞后用’TACO蛋白做细胞免疫荧光表明细胞内TACO表达明显的降低。在293T细胞中,在蛋白质水平检测到了TACO的变化。结论：pST干扰质粒可使taco mRNA及蛋白水平表达下降。第三部分重组耻垢分枝杆菌菌苗rMs-pSTM的构建及鉴定目的：利用经过基因改造的耻垢分枝杆菌Msl-2c作为载体,靶向递送小干扰RNA的真核表达质粒,观察其靶向性。方法：将分枝杆菌的复制子ORIM用分子克隆的方法连入siRNA表达质粒pST1-4中,得到pSTM1-4,然后电穿孔入Msl-2c中,构建可靶向递送pSTM1-4质粒进入MΦ中进行表达的重组耻垢分枝杆菌rMs-pSTM1-4并用PCR的方法鉴定,大量扩增重组耻垢分枝杆菌菌苗rMs-pSTM,并分别用其感染RAW264.7细胞。结果：分枝杆菌的复制子ORIM连入siRNA表达质粒pST中,电穿孔入Msl-2c成功,筛选并大量扩增了耻垢分枝杆菌菌苗rMs-pSTM。感染RAW264.7后,抗酸染色后在细胞中能看到其靶向性。结论：rMs-pSTM感染RAW264.7后,能观察到其靶向性。