论文部分内容阅读
人类皮肤的颜色主要取决于黑色素的合成和分布。agouti与extension早已被认为是控制哺乳动物毛皮中真、伪黑色素相对数量与分布的基因座。其中,extension 基因座编码促黑激素受体1(MClR),是对哺乳动物皮毛颜色起决定作用的关键调控产物。MClR可与垂体前部释放的促黑激素(α-MSH)或肾上腺皮质激素(ACTH)结合,引起cAMP水平的提高,cAMP进一步激活酪氨酸激酶(TYR)及其相关蛋白TYR-1(又称:多巴色素互变酶)、TYR-2(又称:DCT/DHICA氧化酶),它们催化黑色素细胞从血液中摄取的酪氨酸,经高尔基复合体变成多巴及多巴醌,最后合成真黑色素,是皮肤黑色素的主要组分;多巴醌还可通过另一途径经谷光甘肽或半胱氨酸催化生成红或黄色的褐黑素(Phaeomelanin)。
由于MClR在黑素的生成和调节方面起的重要作用,她日渐成为皮肤病治疗上的研究热点。越来越多的人开始研究和探索有效的激动剂和拮抗剂。目前,关于MClR基因拮抗剂鲜有报道,大多都是合成的肽类或类似化合物,可用于临床试验的更是少数。所以寻找发现更有效的化合物或药物原料迫在眉睫。
在本实验验采用的稳定表达人MClR-荧光素酶的中国仓鼠卵巢细胞系 MClR-6CRE-Luci-CHO(MClR)和仅含有相应报告基因的宿主细胞系 6CRE-Luci-CHO(Host)中,均采用置于CRE下游的,对cAMP信号极为敏感的荧光素酶报道基因置换酪氨酸酶基因,所以,利用荧光素酶活性的变化就能够极为方便、高效、灵敏地反映出CRE的调控活性,从而推断在相同条件下酪氨酸酶基因的表达情况。
首先,我们对此重组细胞株模型进行优化,luciferin荧光素为底物,NDP-a-MSH为激活剂标准品,Sepiwhite 为拮抗剂标准品,用SPSS及Graphpad软件进行数据处理,对其主要参数进行优化。最后选择的条件参数为:NDP-a-MSH浓度0.5 nMol/L;Sepiwhite 浓度25 μMol/L;孵育时间5h;荧光素用量从厂商推荐的100μL降到25μL。本体系能够对MClR拮抗/激动剂类药物进行高通量筛选及其作用靶点进行初步判断(MClR或cAMP)。利用我们优化后的细胞筛选模型和方法对2000多种中草药提取物进行了高通量筛选。共得到了对MSH作用抑制率达到60%以上,且细胞活力在80%以上的参试粗提物10种,这10种提取物同时检测了在相应Host细胞中对于Forskolin作用的抑制率。结果表明:补骨脂提取物能明显抑制MSH的作用(82.23%),其抑制率接近于标准品阳性对照(85.11%),而对于Forskolin作用的抑制率仅为22.15%,其差值达近60%,说明其抑制作用在很大程度上不是直接作用于cAMP而是作用于MSH对MClR的激活过程;而其余9种提取物的对于MSH和对于Forskolin的抑制作用率都比较接近,表明它们基本上直接作用于cAMP通路而不是作用于MSH对MClR的激活过程。
实验还检测了这些提取物对小鼠B16-F1细胞系黑色素生成量的影响。其中,补骨脂、破茎松萝、桑根、太白树粗提物能明显降低B16细胞产黑色素的能力。其他6种粗提物在本实验条件下未测出具有抑制效果。本实验为利用上述中草药成分调控皮肤细胞中的色素生成提供了初步证据和线索。
由于本系统所用调控元件的特殊性,对细胞分化、中间代谢、神经元信号传导以及细胞凋亡等多种细胞应答反应过程相关药物的高通量筛选和药理学研究也具有一定的借鉴意义。