棒曲霉（Aspergillus clavatus）是常见的曲霉属真菌，其代谢能够产生多种生物活性物质，具有较好的工业应用前景。有报道表明棒曲霉具有降解塑料的能力，且其产生的多肽类具有抑制肝癌细胞增殖的能力，以及还能产生一种具有灭蚊活性的化合物。另外，本实验室还发现棒曲霉具有高产洛伐他汀的能力。目前对棒曲霉研究焦点主要集中在其代谢能产生的生物酶上，而在基础生物学方面的研究较少，这也使得它的很多功能未得到人们的认知。　　本文以棒曲霉Ac-32菌株为研究材料，在基础生物学方面进行研究，主要研究内容和研究结果如下:　　1.构建农杆菌介导的棒曲霉转化体系　　以棒曲霉分生孢子为受体，以含有pKD1质粒的农杆菌AGL-1菌株为工具，构建了一个农杆菌介导的棒曲霉转化体系，并对影响转化的因素进行了单因素优化，使转化效率达到300-400个转化子/105个孢子，然后对转化子进行分子生物学验证、Southern杂交及激光共聚焦荧光显微镜分析、菌落形态和显微结构分析等。最终筛选了近百株在形态及显微结构上发生较大变化的菌株，为后续棒曲霉基因功能的研究提供了很好的材料。　　2.克隆与分析与分生孢子形成相关的brlA基因和flbA基因，并构建brlA基因的敲除载体　　根据NCBI提供的基因序列设计引物扩增棒曲霉brlA基因和bA基因，并且对基因序列以及其编码的氨基酸序列进行分析，预测其编码蛋白的三级结构，结果发现，brlA基因开放阅读框长度为1290bp，不含内含子，编码429个氨基酸，其编码的蛋白三级结构为C2H2锌指结构，棒曲霉flbA基因长度为2208bp，编码734个氨基酸，三级结构属非典型结构域。然后，扩增brlA基因两端的侧翼序列，从质粒pCB1003中扩增hph基因序列，通过Double-joint PCR（双接头PCR)技术构建棒曲霉brlA基因的敲除载体，再将构建的载体转化至感受态农杆菌AGL-1菌株。　　3.棒曲霉brlA基因缺失突变株的获得与分析　　利用构建的农杆菌介导的棒曲霉转化体系，将构建的敲除载体转化至棒曲霉细胞内，经PCR、Southern杂交、荧光检测及反转录PCR验证，成功确定了一株棒曲霉brlA基因敲除菌株。随后对棒曲霉brlA基因缺失突变株进行菌落形态及显微结构分析，并分析了其分生孢子形成、生长及代谢的变化，发现brlA基因调控棒曲霉色素、分生孢子形成。且对生长及次级代谢也有一定的影响。　　4.棒曲霉brlA基因缺失突变株转录组学分析　　提取棒曲霉brlA基因缺失突变株和野生型菌株的RNA进行RNA-Seq，将测序得到的序列进行质量控制后比对到棒曲霉基因组，分析差异表达的基因，结果发现brlA基因缺失后有2786个基因的表达量发生了显著变化，其中上调基因有1330个，下调基因有1456个，且发生变化的基因其功能多集中在代谢和细胞过程等方面。另外，与无性发育相关的基因多出现下调的情况，而有性发育相关基因则有上调的趋势，表明brlA基因可能有抑制有性生殖激活无性发育的功能。对棒曲霉素生物合成途径中相关基因表达量的分析发现brlA基因的缺失致使棒曲霉素生物合成中大部分基因表达量都出现了下调的情况，表明棒曲霉素的生物合成受brlA基因的影响较大。利用qRT-PCR技术对分生孢子形成和棒曲霉素生物合成调控通路中的数个关键基因进行定量验证，结果表明转录组数据有较高的可信度。　　综上所述，利用农杆菌介导的转化体系将构建的棒曲霉brlA基因缺失突变株转入到棒曲霉细胞内实现了棒曲霉brlA基因的敲除。对棒曲霉brlA基因缺失突变株进行了生理生化分析和转录组学分析，表明brlA基因对棒曲霉的生长发育和代谢都有一定的调控作用。