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癫痫(epilepsy, EP)是一组由大脑神经元异常放电所引起的以短暂性中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病。癫痫发作可导致神经元损伤,其中有一部分是通过细胞凋亡实现的。其中NMDA受体介导的兴奋性毒性是神经元损伤的重要机制之一。谷氨酸是脑内最主要的内源性兴奋性氨基酸。在癫痫、脑外伤与慢性退行性神经疾病等病理过程中,谷氨酸通过激动其突触后膜谷氨酸受体产生兴奋性毒性,参与神经元损害,以NMDA受体介导的兴奋性毒性为主。NMDA受体亦可介导癫痫脑损伤病理中神经胶质细胞活化及产生损伤性物质(如iNOS,ICE等)释放。米诺环素(盐酸二甲胺四环素,minoeyeline hydroehloride)为第二代人工半合成四环类抗生素,其抗菌谱与四环素相似。近年一些研究表明,在脑缺血、脑外伤、阿尔茨海默氏病和帕金森病及边缘叶癫痫发作大鼠模型上,米诺环素均有显著的神经保护作用。由于米诺环素口服后迅速被吸收,脂溶性较高,组织穿透性好,且可以通过血脑屏障作用于中枢神经系统,所以更加引起人们的重视。目前,已报道该类药物神经保护作用的一些机制,米诺环素在各种模型上均表现出了神经保护作用,但其在全身性癫痫模型上对神经元的保护作用,以及药物剂量与神经元的保护作用的关系尚未报道。在全身性癫痫模型中米诺环素能否拮抗NMDA受体,能否抑制NMDA受体介导的兴奋性毒性,其抑制NMDA受体的兴奋性毒性是否通过直接环节发挥作用,米诺环素能否减少凋亡的发生是本实验关注的焦点。目的:用戊四氮(Pentylenetetrazol,PTZ)制造癫痫大鼠模型,用不同剂量的米诺环素进行干预,检测海马区中细胞凋亡,海马CA1、CA3区NMDA受体型亚单位(NR1)表达情况,进一步探讨不同剂量米诺环素对致痫大鼠神经元的作用,米诺环素是否能直接拮抗NMDAR1。方法1分组采用完全随机设计。将60只成年雄性Sprague一Dawley(SD)大鼠随机抽取8只作为正常组(normal),其余52只用戊四氮制造癫痫模型,筛选造模合格大鼠32只随机分为:戊四氮致痫组(PTZ)和致痫后米诺环素每次20mg/kg干预组(MT1)、致痫后米诺环素每次45mg/kg干预组(MT2)、致痫后米诺环素每次90mg/kg干预组(MT3)。2造模正常组腹腔注射生理盐水,致痫大鼠按45mg/kg腹腔注射PTZ溶液,每次注射间隔48小时,直到点燃(出现RacineⅤ级)。3给药各米诺环素干预组于癫痫终止后30分钟内给予米诺环素灌胃。MT1组首剂给予40mg/kg,以后每12小时给予20mg/kg。MT2组首剂给予90mg/kg,以后每12小时给予45mg/kg。MT3组首剂给予180mg/kg,以后每12小时给予90mg/kg。PTZ组和正常组给予蒸馏水灌胃。共灌胃5天。4脑电图将大鼠麻醉后固定于固定架上,采用头皮针状电极单极导联法,于大鼠顶骨正中左右两侧头皮下处留置针灸针,待大鼠清醒后制作模型,观察痫性放电的频率及其振幅变化。5免疫组织化学染色麻醉状态下经左心室行主动脉插管,4%多聚甲醛溶液进行灌注,取脑固定,常规包埋,标本冠状位石蜡切片。经过抗原修复、小牛血清封闭后,加NMDAR1抗体,在经二抗、三抗孵育,DAB显色后置显微镜下观察记录。6原位末端标记DAN片段灌注,固定,常规包埋,切片同上。经脱蜡、蛋白酶消化后,加入TUNEL反应液,滴加复合液,DAB显色,置镜下观察。结果1癫痫行为学造模大鼠均出现不同程度的痫性发作,造模成功。2脑电图致痫大鼠脑电图出现阵发尖波。正常对照组大鼠脑电无异常。3免疫组织化学结果正常组与其它各组之间比较,正常组NMDAR1光密度值最低都具有显著性差异(P < 0. 05)。戊四氮模型(PTZ)组与米诺环素各干预组之间比较,光密度值无显著性差异(P﹥0. 05)。米诺环素各干预组之间光密度值无显著性差异(P﹥0. 05)。光镜下观察,免疫组织化学染色后,正常组NMDAR1阳性细胞在大脑皮质各层内弥散分布,在海马主要分布于锥体细胞层及颗粒细胞层。其它各组与正常组相比,大脑皮层及海马NMDAR1免疫反应染色明显加深,数目增多。4检测TUNEL结果PTZ组与MT1组比较,细胞凋亡数目无显著性差异(P﹥0. 05);PTZ组与MT2组比较,MT2细胞凋亡数少,具有显著性差异(P < 0. 05); PTZ组MT3组比较,MT3组细胞凋亡多,具有显著性差异(P < 0. 05);各干预组之间比较,MT2组细胞凋亡较MT1组、MT3组都少,有显著性差异(P < 0. 05)。MT1与MT3组比较,MT1细胞凋亡数少,有显著性差异(P < 0. 05)。正常组与其它各组比较,Normal组细胞凋亡数目少,有显著性差异(P < 0. 05)。结论1米诺环素每次45mg/kg能减少戊四氮致痫大鼠脑海马区神经元凋亡。米诺环素每次90mg/kg不能减少致痫大鼠海马区神经元凋亡,反而加强大鼠脑神经元凋亡。米诺环素对海马神经元的作用具有双向性。2米诺环素不能减少NMDAR1的阳性表达,可能其不能直接拮抗NMDAR1。其抑制NMDA受体介导的神经毒害作用可能不是直接效应,可能作用于其中间环节的间接效应。