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目的:肝脏缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤是肝脏移植、肝切除和肝外伤等手术过程中所面临的一项重要课题。大量研究表明,肝脏I/R损伤的机制涉及氧化应激、炎症、细胞凋亡等一系列复杂的、多途径调控网络。近年来,多项研究表明内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在肝脏I/R损伤的进展中起着重要作用,抑制ERS可能为肝脏I/R损伤的治疗提供新的思路。越来越多的证据表明,microRNA(miRNA)参与了多种生物学和病理过程,并在细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡和应激反应等多种生物过程中发挥着关键作用。此外,已有报道指出,miRNA可能通过调节几个关键的信号通路而导致肝脏I/R损伤。以往研究表明,在HEK293T细胞中,miR-27a诱导的细胞凋亡与细胞中的ERS有关。最近研究发现,miR-27a抑制剂可以降低GRP78和CHOP的表达,参与ERS反应,进而参与糖尿病肾病的进程。此外多个研究证明,miR-27a通过靶向PPARγ,参与调控多个疾病的I/R进程,而且PPARγ被证实参与调控肝脏I/R损伤。然而,miR-27a在肝脏I/R损伤中的潜在作用尚不清楚。本研究从ERS角度,分别在体内和体外实验中对miR-27a在肝脏I/R损伤中的作用和潜在机制进行了研究。方法:1、体内实验:对大鼠进行缺血1小时,再灌注6小时,建立大鼠肝脏I/R模型。通过肝功能指标检测和HE染色法,对肝功能及肝损伤情况进行检测,血清谷丙转氨酶(ALT)以及谷草转氨酶(AST)通过全自动生化分析仪进行检测。通过实时定量PCR检测大鼠I/R后血清miR-27a的表达情况。为进一步研究miR-27a在体内对肝脏I/R损伤的作用,对I/R大鼠进行miR-27a antagomir或miR-27a NC腹腔注射;通过实时定量PCR检测miR-27a的相对含量;采用TUNEL法对各组肝细胞凋亡情况进行检测;采用Western blot检测组织中GRP78、CHOP、PPARγ的蛋白水平。2、体外实验:通过Targetscan对miR-27a的作用靶点进行预测,进一步通过荧光素酶报告基因技术对靶基因进行验证。为了进一步证实miR-27a对肝脏I/R损伤的影响,我们使用AML12细胞系,通过缺氧4小时后复氧12小时建立H/R模型;通过Lipofectamine 2000分别转染miR-27a mimics、miR-27a inhibitors或PPARγsiRNA,CCK8对细胞活力进行检测。此外,使用细胞流式实验检测细胞凋亡情况;采用实时定量PCR检测各组细胞miR-27a的相对含量;Western blot用于检测细胞中GRP78、CHOP的蛋白水平,并对各组细胞的MDA的含量及SOD活性进行检测,以研究miR-27a对氧化应激的影响。结果:1、大鼠经肝脏I/R处理后,血清中ALT及AST水平均显著提高,组织学检测可观察到模拟组大量肝细胞坏死,且在坏死区域可见大量炎性细胞浸润,说明本研究成功建立大鼠肝脏I/R模型。2、在体内实验中发现,大鼠经肝脏I/R处理后,其血清miR-27a水平及GRP78和CHOP的蛋白水平均显著升高,说明肝脏I/R处理诱导大鼠的内质网应激反应,且miR-27a可能参与了大鼠的肝脏I/R进程。3、在体外实验中发现,H/R处理后细胞miR-27a水平显著增加。通过miR-27a mimics和miR-27a inhibitors转染AML12细胞,CCK8检测细胞活力,结果显示,与对照组相比,miR-27a抑制剂显著提高了细胞活力;用流式细胞术检测了miR-27a对细胞凋亡的影响,与对照组相比,H/R组凋亡细胞明显增多,miR-27a抑制剂能有效抑制H/R引起的细胞凋亡。这些结果表明,抑制miR-27a可能对肝脏I/R损伤有保护作用。此外,MiR-27a低表达显著抑制了H/R引起的MDA含量的升高,同时缓解了H/R引起的SOD活性的降低;同样地,miR-27a低表达显著降低GRP78和CHOP的表达水平。我们的数据表明,miR-27a在H/R诱导的肝细胞损伤中调节氧化应激和ERS信号通路。4、通过Targetscan对miR-27a的作用靶点进行预测,发现PPARγ是miR-27a的候选目标基因之一,进一步荧光素酶报告基因技术对靶基因进行了验证。Western blot结果发现,miR-27a显著抑制H/R诱导的肝细胞PPARγ的升高。干扰PPARγ后显著抑制了miR-27a inhibitors对ERS的缓解作用。5、为了研究miR-27a在体内对肝脏I/R损伤的治疗作用,我们用人工合成的miR-27a antagomir和miR-27a NC经腹腔注射转染大鼠。结果发现,大鼠miR-27a antagomir注射后,血清的ALT和AST的水平显著降低,且I/R诱导的肝细胞坏死及细胞凋亡明显减少。此外,大鼠miR-27a antagomir注射显著提高了PPARγ的水平,并抑制了I/R诱导的肝脏氧化应激及ERS。结论:综上所述,本研究表明,抑制miR-27a的表达能够减轻肝脏I/R损伤,并通过靶向PPARγ抑制肝细胞ERS发挥作用。此研究为减轻临床肝脏I/R损伤提供了新的思路和靶点。