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大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)能够消化利用箭竹(Fargesia)中纤维素类物质,但目前尚未在大熊猫基因组中发现编码纤维素酶的相关基因,可见大熊猫消化纤维素是依赖其肠道中微生物的作用。本研究旨在从大熊猫粪便中分离筛选出产纤维素酶的芽孢杆菌菌株,为纤维素的发酵利用提供菌种资源。 本文首先从大熊猫粪便中分离出具有纤维素降解活性的菌株126株,利用平板扩散法从中筛选出76株可使刚果红平板产生明显透明圈的菌株。通过纤维素酶酶活测定,得到8株酶活较高的菌株(CMC酶活力均高于45.00U/mL),分别为2N-12、2N-14、Y-6、Y-10、2N-10、3X-10、2L-24、2L-9。 通过16S rDNA序列分析,结合菌株的形态特征和生理生化试验结果,初步鉴定菌株2N-12为阿萨尔基芽孢杆菌(Bacillus axarquienis),2N-14为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),Y-6、Y-10为西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis),2N-10、3X-10、2L-24、2L-9为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。 在不同生长条件下对B.axarquienis2N-12、B.subtilis2N-14、B.siamensis Y-10、B.methylotrophicus3X-10进行了生长特性及对肠道病原菌的拮抗活性测定,结果显示,菌株2N-14、Y-10、3X-10均可在pH4.0~7.0的条件下良好生长、且耐胆酸盐,并对肠道病原菌有较强的抑制作用。 通过单因素试验确定了3菌株摇瓶培养条件下的碳源、氮源、无机盐种类,由Plackett-Burman筛选确定主要影响因素,结合响应面分析对菌株产芽孢发酵条件进行优化。优化后2N-14菌株的芽孢产量为3.18×109CFU·mL-1,比优化前的5.39×108CFU·mL-1增加4.90倍;Y-10菌株的芽孢产量为2.52×109CFU·mL-1,比优化前的8.08×108CFU·mL-1增加2.12倍;3X-10菌株的芽孢产量为3.22×109CFU·mL-1,比优化前的8.07×108CFU·mL-1增加2.99倍。 在含水量55~65%的玉米秸秆中添加上述菌剂1.0×109CFU·kg-1秸秆,厌氧发酵45d,开窖后对发酵秸秆进行了感观评价及理化指标检测分析。结果显示,各试验组和青贮对照组感官评价均为优等;与青贮对照组相比,3个添加不同菌剂试验组的理化检测指标结果差异显著。其中添加3X-10菌剂的试验组发酵效果最优,发酵秸秆的pH为3.79;乳酸、乙酸含量分别为2.74%、0.65%,比对照组提高了21.78%(P<0.05)、29.31%(P<0.05);氨氮/总氮为0.0643,比对照组降低了54.53%(P<0.05);粗蛋白含量为6.93%,比对照组提高了10.17%(P<0.05);粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素的含量分别为27.47%、47.87%、30.07%、2.07%,与青贮对照组相比分别降低了29.65%(P<0.05)、20.15%(P<0.05)、18.97%(P<0.05)、17.86%(P<0.05)。 对发酵秸秆的有氧稳定性进行了评价。结果显示,青贮对照组在第8d高于外界温度2.15℃,pH3.85,开始呈现不稳定状态,而添加3X-10菌剂的试验组在第12d时仍无明显升温现象,pH值为3.86;氨氮/总氮低于青贮对照组。各项指标测定结果均显示添加3X-10菌剂可显著提高发酵秸秆的有氧稳定性。