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第一部分:RT-MPs通过诱导肿瘤细胞铁死亡介导放疗旁观者效应目的:受到放射的细胞发生损伤或死亡时,其周围未受放射的细胞亦会发生放射损伤或死亡,这种现象被称为放射治疗旁观者效应（Radiation-induced bystander effect,RIBE）,目前,放疗产生RIBE的机制尚未十分清楚。本研究以体外受照射的肿瘤细胞为研究对象,分离并鉴定细胞培养上清中能介导RIBE的产物,探究该产物引起RIBE的机制。方法:体外培养的肿瘤细胞（A549、LLC、B16-F10等）接受单次X线20 Gy照射,3天后分离细胞培养上清,通过差速离心分别获得微泡（Irradiated tumor cell-released microparticles,RT-MPs）、外泌体（Exosomes,Exo）以及去除RT-MPs和/或Exo的上清（Cultural supernatant without MPs and/or Exo,CSWPE）,分别将RT-MPs、Exo加入新鲜培养基中,或用含50%的CSWPE培养细胞48 h,通过CCK-8、平板克隆形成,鉴定能够抑制肿瘤细胞增殖的具体成分。随后,分别用铁死亡、凋亡、坏死、自噬抑制剂处理细胞,鉴定细胞的死亡方式,接着通过蛋白质质谱从蛋白水平探究细胞分子通路改变。流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）检测细胞总活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和膜ROS的含量,透射电镜检测细胞线粒体形态。结果:平板克隆形成试验显示,分别用含RT-MPs、Exo或CSWPE的培养基培养细胞48h后,其中RT-MPs组细胞克隆数量显著少于其他组;CCK-8试验也得出相同结果。分别用铁死亡、凋亡、坏死、自噬抑制剂处理细胞后,该研究发现仅有广谱的铁死亡抑制剂GSH和特异性脂ROS清除剂Fer-1能逆转细胞死亡;蛋白质谱分析发现,RT-MPs处理细胞后,铁死亡相关蛋白PTGS2和FTL1等在RT-MPs处理组显著升高,铁死亡相关通路也显著富集;透射电镜检测发现,与阴性对照组相比,RT-MPs组细胞线粒体明显皱缩,着色加深。RT-MPs处理细胞4 h、12 h、24 h后,细胞膜ROS和总ROS均明显升高,且ROS的升高可被广谱的铁死亡抑制剂GSH和特异性铁死亡抑制剂Fer-1逆转。结论:RT-MPs是介导放疗旁观者效应的主要物质载体,其通过诱导肿瘤细胞发生铁死亡杀伤临近肿瘤细胞。第二部分:RT-MPs调控肿瘤免疫微环境（Tumor microenvironment,TME）的转化医学研究目的:基于RT-MPs体外能够杀伤肿瘤细胞,该研究对RT-MPs体内抑制恶性胸水（Malignant pleural effusion,MPE）和黑色素瘤的效果、安全性及相关机制做进一步探索。方法:免疫荧光（Immunofluorescence,IF）和FCM检测肿瘤细胞表面钙网蛋白（Calreticulin,CRT）的表达,luciferin-based ENLITEN?ATP Assay检测培养上清ATP释放;CX3CR1+/GFP小鼠皮窗模型观察体内肿瘤细胞被巨噬细胞清除的过程。将PKH-26标记的RT-MPs注射到患有MPE的小鼠胸腔,通过FCM分析胸水中摄取RT-MPs的细胞亚群;通过RNA测序分析吞噬RT-MPs的巨噬细胞差异的分子通路和基因,RT-PCR验证主要差异基因的表达,Western-blotting（WB）验证差异活化的分子通路;FCM检测体内外免疫细胞的比例和表型改变,采用单克隆抗体清除特定的免疫细胞亚群;小动物活体成像监测小鼠MPE的进展,每日记录小鼠存活并做生存分析;通过血常规、血生化,以及各脏器HE染色评估治疗的安全性。结果:A549和LLC细胞经RT-MPs处理24 h后,两种细胞表面CRT表达水平及培养上清中ATP含量均显著增加;通过小动物皮窗技术,我们观察到吞噬RT-MPs的LLC细胞会很快被巨噬细胞清除;将标记有PKH-26的RT-MPs注入患有MPE的小鼠胸腔4 h后,F4/80+的巨噬细胞摄取RT-MPs的比例最高;RNA测序结果显示,巨噬细胞吞噬RT-MPs后,JAK-STAT和MAPK通路显著活化,相关通路p-STAT1、p-p38、p-ERK、p-JNK均在数分钟内表达明显增加,RT-PCR检测发现IL-1β、IL-12p40等基因表达显著升高;FCM检测结果表明,巨噬细胞CD86、MHC-Ⅱ表达升高,CD206表达下降。在小鼠体内也得出同样结果,吞噬RT-MPs的巨噬细胞表面CD206表达下降。皮窗显示活体内巨噬细胞吞噬RT-MPs后,吞噬肿瘤功能显著增强;吞噬RT-MPs24 h后,的巨噬细胞PD-L1表达水平也显著升高,RT-MPs单独或与PD-1单抗联合,可显著改善MPE免疫微环境,CTL、Th1细胞比例显著升高,MDSC显著减少,且可治愈部分小鼠,治愈小鼠最长存活时间可达227天,且再次接种的肿瘤细胞不能生长。清除CTL可显著削弱RT-MPs联合PD-1单抗对MPE的疗效,其次是巨噬细胞和Th1细胞,而清除NK细胞对疗效无影响。RT-MPs与PD-1单抗联合,在顺铂耐药的MPE模型中,也获得了较好的治疗效果。接受联合治疗方案治疗的小鼠,血常规、血生化,以及各脏器HE染色均未发现异常。结论:RT-MPs体内具有抗肿瘤效果,联合PD-1单抗可使部分小鼠治愈,对顺铂耐药的MPE也同样有效,且表现出较高的安全性。RT-MPs发挥疗效可能通过以下3个途径:（1）吞噬RT-MPs的肿瘤细胞表现出免疫原性死亡的特征,更易被巨噬细胞清除;（2）巨噬细胞吞噬RT-MPs后,通过JAK-STAT和MAPK通路向M1型极化;（3）RT-MPs单独或联合PD-1单抗可显著改善小鼠MPE免疫微环境。